Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Nuestra investigación se centró en el desarrollo de un método simplificado para separar las proteínas insolubles de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis en fracciones simples para ensayos proteómicos e inmunológicos directos. Los avances en las técnicas electroforéticas ahora permiten separar proteínas complejas en menos fracciones de proteínas, lo que facilita un aislamiento eficiente basado en espectrometría de masas para aplicaciones proteómicas e inmunológicas funcionales. Los desafíos clave incluyen una solubilidad deficiente de la proteína hidrofóbica que precipita más de cien miligramos y la desnaturalización inducida por SDS-PAGE, lo que dificulta la aplicación posterior que necesita confirmación nativa como los ensayos de actividad enzimática.

Ningún protocolo actual separa sistemáticamente las proteínas hidrofóbicas insolubles de la pared celular y la membrana celular en fracciones solubles en agua definidas para el análisis proteómico e inmunológico directo, que es clave para comprender la función y guiar las intervenciones. Nuestra investigación futura se centrará en el desarrollo de diagnósticos basados en antígenos de células T y en evaluar su sensibilidad, especificidad y rendimiento en toda la población de TB para una detección temprana y precisa de la TB con el objetivo de apoyar un mejor control de la enfermedad. Para comenzar, obtenga la pared celular, la membrana celular y las muestras de proteínas citosólicas del lisado celular completo de los bacilos de Mycobacterium tuberculosis.

Solubilizar la pared celular y las proteínas de la membrana celular en tampón de enfoque isoeléctrico. Agregue 2% de anfólitos entre rangos de pH de 3 a 10 y 4 a 6 en una proporción de uno a cuatro. Ahora fraccione las proteínas solubilizadas en un sistema de enfoque isoeléctrico líquido mantenido a cuatro grados Celsius con un baño de agua de enfriamiento.

Realice la separación de enfoque isoeléctrico siguiendo las instrucciones del fabricante aplicando una potencia constante de 12 vatios. Recoger las fracciones individuales de enfoque isoeléctrico con una bomba de vacío. Determine los valores de pH de cada fracción.

Someter 50 microgramos de las fracciones separadas a SDS-PAGE y visualizar las proteínas utilizando tinción de Coomassie Brilliant Blue o plata. Comience mezclando las fracciones de pared celular y membrana celular separadas por IEF con tampón de muestra de electroforesis en gel SDS. Calentar la mezcla a 95 grados centígrados durante cinco minutos.

Separe las fracciones de proteínas en la segunda dimensión, utilizando geles de poliacrilamida de 16 por 20 centímetros con un gel de resolución al 12,5% y un gel de apilamiento al 4%. A continuación, utilice un único pocillo de muestra de 13 centímetros de largo para cargar la muestra en el gel. Realice electroforesis a una corriente constante de 50 miliamperios por gel hasta que el frente del tinte llegue al fondo del gel.

Después de la electroforesis, equilibre el gel en tampón de elución durante 10 minutos. Transfiera el gel a un aparato de elusión de gel completo según las instrucciones del fabricante del instrumento. Haga funcionar el elutor a una corriente constante de 250 miliamperios durante una hora para eluir las proteínas del gel, luego use una bomba de vacío para recolectar aproximadamente 30 fracciones de proteínas, cada una de las cuales mide tres mililitros, del gel.

Cuantifique la concentración de proteínas en las fracciones eluidas utilizando el ensayo de proteínas de ácido bicinconínico. Someter 10 microgramos de las fracciones proteicas eluidas al análisis SDS-PAGE y visualizar las bandas mediante tinción con azul brillante de Coomassie. Se observaron distintos patrones de bandas de proteínas en las primeras fracciones de sobrenadante: pared celular, membrana celular y citosol de Mycobacterium tuberculosis, lo que confirma el fraccionamiento subcelular exitoso.

El enfoque isoeléctrico de las proteínas de la pared celular mostró la mayor concentración de proteínas en fracciones con pH inferior a 2,5. SDS-PAGE de las fracciones de IEF de la pared celular reveló distintas bandas de proteínas, predominantemente en las fracciones 1 a 8. La separación de proteínas de la membrana celular por IEF reveló picos importantes de concentración de proteínas entre pH 4 y pH 10, con la concentración más alta alrededor de pH 10.

SDS-PAGE de las fracciones de IEF de la membrana celular mostró diversos perfiles de proteínas con bandas más claras en las fracciones 1 a 9. La separación SDS-PAGE preparativa de las proteínas de la pared celular resueltas por IEF produjo fracciones predominantemente inferiores a 100 microgramos por mililitro. SDS-PAGE de las fracciones de proteínas de la pared celular eluidas mostraron una amplia gama de pesos moleculares de proteínas, con bandas más concentradas en las fracciones 6 a 10.

El SDS-PAGE preparativo de las fracciones de proteínas de la membrana celular reveló que más de la mitad de las fracciones tenían concentraciones de proteínas entre 50 y 199 microgramos por mililitro. SDS-PAGE de las fracciones de proteínas de la membrana celular eluidas revelaron bandas concentradas en los carriles 1 a 8 y 13 a 16.