Name: Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-09-26T13:00:00.000+00:00
Duration: 6 min 14 s
Description: Aprende a separar proteínas insolubles de la pared celular y membrana de Mycobacterium tuberculosis mediante enfoque isoeléctrico preparativo y separación por peso molecular. Este método facilita análisis proteómicos e inmunológicos directos para el desarrollo de diagnósticos de tuberculosis.

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<ol><li>Seshadri, C., Turner, M. T., Lewinsohn, D. M., Moody, D. B., Van Rhijn, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lipoproteins+are+major+targets+of+the+polyclonal+human+T+cell+response+to+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Immunol%22%5BJournal%5D)">Lipoproteins are major targets of the polyclonal human T cell response to Mycobacterium tuberculosis.</a> J Immunol. 190 (1), 278-284 (2013).</li>
<li>Kunnath-Velayudhan, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Dynamic+antibody+responses+to+the+Mycobacterium+tuberculosis+proteome%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Dynamic antibody responses to the Mycobacterium tuberculosis proteome.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (33), 14703-14708 (2010).</li>
<li>Drage, M. G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((TLR2+and+its+co-receptors+determine+responses+of+macrophages+and+dendritic+cells+to+lipoproteins+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Immunol%22%5BJournal%5D)">TLR2 and its co-receptors determine responses of macrophages and dendritic cells to lipoproteins of Mycobacterium tuberculosis.</a> Cell Immunol. 258 (1), 29-37 (2009).</li>
<li>Wallin, E., von Heijne, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+integral+membrane+proteins+from+eubacterial%2C+archaean%2C+and+eukaryotic+organisms%5BTitle%5D)+AND+%22Protein+Sci%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of integral membrane proteins from eubacterial, archaean, and eukaryotic organisms.</a> Protein Sci. 7, 1029-1038 (1998).</li>
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<li>Covert, B. A., Spencer, J. S., Orme, I. M., Belisle, J. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+application+of+proteomics+in+defining+the+T+cell+antigens+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">The application of proteomics in defining the T cell antigens of Mycobacterium tuberculosis.</a> Proteomics. 1 (4), 574-586 (2001).</li>
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<li>Deenadayalan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+Integrated+approach+for+proteomic+and+immunological+analysis+of+cell+wall+and+cell+membrane+proteins+of+Mycobacterium+tuberculosis%5BTitle%5D)+AND+%22Med+Res+Arch%22%5BJournal%5D)">An Integrated approach for proteomic and immunological analysis of cell wall and cell membrane proteins of Mycobacterium tuberculosis.</a> Med Res Arch. 11 (11), (2023).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Caldo 7H9&nbsp;</td><td>Himedia&nbsp;</td><td>M198</td><td></td></tr><tr><td>40% Bio-Lyte 3/10 Ampholyte&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1631113</td><td></td></tr><tr><td>Ensayo de proteína BCA&nbsp;</td><td>MERCK</td><td>BCA1</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Lyte 5/7 Anfolito</td><td>BIO-RAD</td><td>1631152</td><td></td></tr><tr><td>concentradores centrífugos 3 kDa</td><td>MERCK</td><td>Z629456</td><td></td></tr><tr><td>Digitonina.</td><td>MERCK</td><td>D141</td><td></td></tr><tr><td>ADN</td><td>MERCK</td><td>11284932001</td><td></td></tr><tr><td>TDT</td><td>MERCK</td><td>D9779</td><td></td></tr><tr><td>EDTA</td><td>MERCK</td><td>E9884</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td><td>MERCK</td><td>E3889</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>MERCK</td><td>G5516</td><td></td></tr><tr><td>Leupeptina</td><td>MERCK</td><td>E18</td><td></td></tr><tr><td>Pepstatina A</td><td>MERCK</td><td>P5318</td><td></td></tr><tr><td>PMSF</td><td>MERCK</td><td>78830</td><td></td></tr><tr><td>Rnasa</td><td>MERCK</td><td>10109134001</td><td></td></tr><tr><td>Rotofor&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>170-2986</td><td>&nbsp; aparato de enfoque isoeléctrico (IEF)</td></tr><tr><td>Sonicador</td><td>Vibra-Cell, Sónicos</td><td>VC 750</td><td></td></tr><tr><td>TLCK</td><td>MERCK</td><td>T7254</td><td></td></tr><tr><td>TPCK</td><td>MERCK</td><td>4376</td><td></td></tr><tr><td>urea</td><td>MERCK</td><td>U5378</td><td></td></tr><tr><td>Aparato de elute de gel completo&nbsp;</td><td>BIO-RAD</td><td>1651250</td><td></td></tr></tbody></table>

separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Separation and Fractionation of Cell Wall and Cell Membrane Proteins from Mycobacterium tuberculosis for Downstream Protein Analysis

Aislamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular mediante ultracentrifugación de alta velocidad Las proteínas de la pared celular y la membrana se aislaron de lisados celulares completos mediante ultracentrifugación como se describe en el protocolo. El análisis SDS-PAGE de las fracciones subcelulares separadas: pared celular, membrana celular y perfiles de proteínas del citosol de M. tuberculosis se muestra en la Figura 1.
<p class="jove_con...

Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

Mycobacterium cell wall and membrane proteins, which play a central role in tuberculosis pathogenesis, were successfully separated using preparative ...

separation-fractionation-cell-wall-cell-membrane-proteins-from

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Fuente: Gupta, S., Marcela Rodríguez, G. Aislamiento y caracterización de vesículas extracelulares producidas por micobacterias limitadas en hierro. J. Vis. Exp. (2019)Este video demuestra el aislamiento escalonado de vesículas extracelulares (EV) de Mycobacterium tuberculosis cultivadas en condiciones limitantes de hierro que imitan el entorno del huésped. Describe el uso de la ultrafiltración, la centrifugación diferencial y la separación por gradiente de densidad para enriquecer e...

Aislamiento de vesículas extracelulares que contienen sideróforos de Mycobacterium tuberculosis

Este video muestra la separación de ácidos micólicos basada en cromatografía de capa fina. Esta técnica separa los diferentes ácidos micólicos (lípidos de cadena larga presentes en la pared celular de las micobacterias) en función de su polaridad.

Separación de variantes de ácido micólico basada en cromatografía de capa fina: un método para separar los lípidos de la pared celular micobacteriana en función de la polaridad

Este video muestra la técnica de cromatografía de exclusión por tamaño (SEC) para purificar vesículas extracelulares (EV) bacterianas del filtrado de cultivo de Mycobacterium tuberculosis (Mtb). La técnica utiliza una columna porosa empaquetada de resina para obtener fracciones purificadas de EV. Las partículas porosas permiten selectivamente que las proteínas más pequeñas entren en los poros, lo que resulta en una elución más lenta. Al mismo tiempo, los EV están excluidos de entrar en los...

Una técnica de cromatografía de exclusión por tamaño para purificar vesículas extracelulares micobacterianas

La pared celular bacteriana está compuesta de peptidoglicano, una red macromolecular de hebras de azúcar reticuladas por péptidos. La cromatografía líquida de ultra rendimiento proporciona alta resolución y rendimiento para nuevos descubrimientos de la composición de peptidoglicanos. Presentamos un procedimiento para el aislamiento de las paredes celulares (sacculi) y su posterior preparación para su análisis a través de UPLC.

Aislamiento Y Preparación De Paredes Celulares Bacterianas Para El Análisis Compositiva Por Cromatografía Líquida De Ultra Rendimiento

Las bacterias gramnegativas producen dos membranas segregadas espacialmente. La membrana externa se divide a partir de la membrana interna por una periplasma y una capa de peptidogglicano. La capacidad de aislar las bicapas duales de estos microbios ha sido fundamental para entender su fisiología y patogénesis.

Separación del sobre celular para bacterias gramnegativas en fracciones de membrana interna y externa con ajustes técnicos para Acinetobacter baumannii

Se presenta un protocolo para extraer el contenido total de lípidos de la pared celular de una amplia gama de micobacterias. Además, se muestran protocolos de extracción y análisis de los diferentes tipos de ácidos micólicos. También se proporciona un protocolo cromatográfico de capa delgada para monitorear estos compuestos micobacterianos.

Análisis de la composición lipídica de micobacterias por cromatografía de capa delgada

Las vesículas bacterianas desempeñan un papel importante en la patogénesis y tienen aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La heterogeneidad de las vesículas complica el análisis y el uso; por lo tanto, es necesario un método simple y reproducible para separar los diferentes tamaños de vesículas. Aquí, demostramos el uso de la cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas heterogéneas producidas por Aggregatibacter actinomycetemcomitans.

Cromatografía de exclusión de tamaño para analizar la heterogeneidad de las vesículas de la membrana externa bacteriana

Este protocolo describe la cromatografía de exclusión de tamaño, una técnica fácil y reproducible para enriquecer vesículas extracelulares de Mycobacterium tuberculosis a partir de sobrenadantes de cultivo.

Mycobacterium tuberculosis Enriquecimiento de vesículas extracelulares mediante cromatografía de exclusión de tamaño

Este protocolo detalla el enriquecimiento de vesículas extracelulares micobacterianas nativas (mEVs) de cultivos axénicos de Mycobacterium smegmatis (Msm) y cómo se pueden diseñar y enriquecer msmEVs recombinantes que contienen mCherry (un reportero fluorescente rojo). Por último, se verifica el novedoso enfoque con el enriquecimiento de MsmEVs que contienen la proteína EsxA de Mycobacterium tuberculosis.

Enriquecimiento de vesículas extracelulares nativas y recombinantes de micobacterias

Aunque los procariotas carecen de un sistema orgánular, hay regiones subcelulares con proteínas localizadas. El análisis cuantitativo y cualitativo de las enzimas y proteínas en las regiones subcelulares es importante para desarrollar objetivos farmacológicos y vacunales. Aquí, ilustramos el fraccionamiento subcelular de proteínas Leptospiral utilizando Triton X-114 y su análisis.

Enriquecimiento de proteínas subcelulares en Leptospira mediante un enfoque de fraccionamiento basado en Triton X-114

Este protocolo describe el cultivo, la recolección y la concentración de las proteínas secretadas de Mycobacterium tuberculosis. Las proteínas filtradas de cultivo (CFP) se cuantifican, se separan en 20 fracciones mediante enfoque isoeléctrico y se resuelven en 30 fracciones utilizando un SDS-PAGE preparativo y un sistema de electroelución.

Separación y fraccionamiento de proteínas filtradas de cultivo (CFPs) de Mycobacterium tuberculosis

Aprende a separar proteínas insolubles de la pared celular y membrana de Mycobacterium tuberculosis mediante enfoque isoeléctrico preparativo y separación por peso molecular. Este método facilita análisis proteómicos e inmunológicos directos para el desarrollo de diagnósticos de tuberculosis.

Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo (Video) | JoVE Journal

Separación y fraccionamiento de proteínas de la pared celular y la membrana celular de Mycobacterium tuberculosis para el análisis de proteínas aguas abajo

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