Disposición espacialmente compacta de secciones de larvas de pez cebra para análisis transcriptómico espacial

En el laboratorio Morhardt, utilizamos el pez cebra como modelo animal para estudiar el desarrollo y la función de la vejiga. Hemos identificado una vejiga urinaria funcional que se llena y se vacía en el pez cebra. Si bien el pez cebra es pequeño, buscamos aprovechar su tamaño para utilizar de manera económica técnicas transcriptómicas espaciales y nuestra comprensión de la vejiga de los vertebrados.

Las técnicas transcriptómicas espaciales pueden resultar rápidamente costosas si no se optimizan los reactivos y el equipo. Este protocolo proporciona una técnica probada para lograr esto utilizando el pez cebra y proporciona información sobre los resultados esperados y la mitigación de problemas que pueden surgir como resultado de la tecnología. Además de la utilización económica de costosas tecnologías transcriptómicas espaciales, este trabajo nos ha permitido realizar análisis transcriptómicos espaciales a gran escala de órganos esencialmente completos a lo largo de varias edades, minimizando al mismo tiempo los efectos de lotes.

Para comenzar, enfríe el criostato a 22 grados centígrados y reúna todos los elementos necesarios. Prepare un molde de plástico desechable para la alineación de la muestra. Coloca un trozo de cinta de laboratorio en el interior del molde base y dibuja una línea recta a través de él con un rotulador permanente como punto de referencia.

Marque el interior del molde base para garantizar la orientación adecuada de la muestra durante la criosección. Después de cebar la boquilla de la botella de medio de congelación, dispense la cantidad necesaria en una esquina del molde base. Incline lentamente el molde base para distribuir uniformemente el medio.

Ahora, coloque el molde base con medio de congelación en un baño de hielo e incube durante al menos 10 minutos para enfriar el medio. A continuación, agregue una parte de etanol 100% a una parte de hielo seco en un cubo de hielo debajo de la campana extractora. Coloque el plato o bote de aluminio desechable en el baño de hielo y cubra el balde durante cinco a 10 minutos.

Recoja los peces sacrificados después de sumergirlos en agua a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Con pinzas de punta fina, agarre la aleta caudal para extraer el pez y presiónelo suavemente contra una toallita absorbente sin pelusa para secarlo. Coloque el molde base preparado bajo un microscopio estereoscópico con un aumento de 10x.

Coloque la muestra en el molde a lo largo del punto de referencia en la orientación correcta. Cubra suavemente la muestra con otra capa delgada de medio de congelación. Utilice un punto de referencia anatómico para alinear el pez con precisión con las líneas marcadas dentro del molde base y ajuste la orientación con pinzas de punta fina, evitando burbujas.

Aplique un trozo de hielo seco en el fondo del molde base debajo de la muestra hasta que se congele localmente en su posición. Mantenga un plano horizontal nivelado para evitar la desalineación de la muestra antes de congelarla por completo. Ahora coloque el molde base con la muestra en el bote o plato de aluminio en el baño de hielo seco y etanol.

Asegúrese de que el bote permanezca flotando en la superficie y que el molde base permanezca seco. Cubra el baño y deje que las muestras se congelen durante 10 minutos. A continuación, envuelva el molde base congelado en papel de aluminio y guárdelo en un congelador a 80 grados centígrados hasta que esté listo para seccionar.

Lleve el molde base congelado al criostato preenfriado para la crisección y colóquelo en la cámara del criostato. Después de retirar el portaobjetos de imágenes espaciales del almacenamiento, colóquelo en un soporte de portaobjetos preenfriado. Guarde el portaobjetos con el portaobjetos de imágenes espaciales en la cámara de criostato a 22 grados centígrados hasta que esté listo para la recolección de secciones.

Ahora, retire la muestra congelada del molde base y colóquela en un mandril con medio de congelación fresco, asegurándose de que la superficie de corte mire hacia la cuchilla del micrótomo. A continuación, coloque una cuchilla de micrótomo fina y fresca en el criostato. Después de alinear el molde con la cuchilla, recorte la región de interés con un grosor recomendado de 20 a 50 micrómetros.

Asegúrese de que las marcas dentro del molde se transfieran al bloque congelado para una orientación adecuada de la muestra. Ajuste el molde durante el recorte para que la superficie de corte permanezca paralela a las marcas de referencia en el medio de congelación. Corte secciones del bloque congelado y recójalas en un portaobjetos de microscopio estándar con carga positiva.

Revise las secciones bajo un microscopio de campo claro para confirmar que el recorte se ha completado. A continuación, retire el portaobjetos de imágenes espaciales de la cámara de criostato y colóquelo en un baño de hielo de cuatro grados centígrados, mientras lo mantiene dentro del soporte de portaobjetos. Comience la crisección con un grosor recomendado de 10 a 14 micrómetros.

Recopile secciones en diapositivas cargadas positivamente hasta que se alcance la región de interés. Ahora recupere el portaobjetos de imágenes espaciales de una sola célula del baño de hielo y retire el portaobjetos del soporte. Recoja las secciones fila por fila con un pincel de punta fina para evitar que se enrollen.

A continuación, presione una esquina del medio de congelación vacío sobre la platina del cuchillo con la parte posterior de un pincel. Use la parte superior del portaobjetos como punto de pivote y baje lentamente el portaobjetos sobre la sección para dejar que se adhiera durante tres segundos antes de levantarlo. Alinee las secciones en serie paralelas entre sí para maximizar el espacio en la guía.

Después de recoger secciones de la región de interés, vuelva a colocar la corredera en el soporte de la corredera. Si no se necesitan más muestras, guarde el portaobjetos a 80 grados centígrados durante un máximo de dos semanas antes del análisis. Recoja secciones antes y después de la región de interés en un portaobjetos de microscopio estándar con carga positiva y realice la tinción con hematoxilina y eosina para evaluar la alineación de la muestra y la calidad de la sección antes de continuar con el análisis.

La alineación de múltiples secciones se verificó comparando estructuras entre secciones en el mismo corte. Los ajustes en los pasos de inclusión y recolección permitieron que un mayor número de secciones cupieran dentro del área de imagen de un portaobjetos transcriptómico espacial. La calidad de la señal transcriptómica espacial fue alta dentro de las regiones tisulares, pero menor en las áreas de portaobjetos vacíos debido a la baja complejidad de la señal.