In situ Aislamiento y cultivo de bacterias recalcitrantes del suelo mediante un chip de aislamiento (iChip)

Existen ricos depósitos de microbios en diversos entornos naturales, como el suelo, los cuerpos de agua y los entornos extremos. Sin embargo, aprovechar esta enorme biodiversidad está limitado en gran medida por los métodos y medios de laboratorio. Al superar esta barrera cultural y aprovechar esta biodiversidad, tiene el potencial de abordar diversas necesidades biotecnológicas, así como de resolver desafíos globales.

Por ejemplo, el desarrollo de la resistencia a los antimicrobianos se ha convertido en un factor de salud pública mundial. Las bacterias del suelo que son difíciles de cultivar en el laboratorio pueden producir nuevos compuestos bioactivos con una potente actividad antimicrobiana que podrían ser valiosos para abordar el desafío global de los sistemas antimicrobianos. La enorme variedad de microbios ambientales y su producto no se han explorado, ya que las tecnologías tradicionales basadas en cultivos de laboratorio a menudo conducen al aislamiento de microbios conocidos similares. El objetivo de este experimento es demostrar el cultivo de alto rendimiento de bacterias recalcitrantes del suelo in situ utilizando la tecnología IChip. En este protocolo, demostraremos la construcción y el uso de esta tecnología IChip que se puede utilizar para el cultivo in situ de alto rendimiento de bacterias difíciles de cultivar y la recuperación de bacterias productoras de antimicrobianos como una aplicación de esta tecnología.

[Presentador] Para comenzar, cree un diseño preliminar de las placas superior, inferior y media del chip de aislamiento en un software de presentación. Utilice la opción de inserción de forma en el software de presentación para insertar círculos de dimensiones necesarias para que sirvan como IChip. Inserte círculos más pequeños dentro para representar los canales IChip. Organice los círculos más pequeños en el patrón deseado para preparar un diseño preliminar para la placa superior, inferior y central del IChip. Seleccione el diseño y use el menú contextual para guardar el diseño preliminar como una imagen. Usando el diseño preliminar como plantilla, comience a crear un diseño bidimensional utilizando un software de diseño asistido por computadora. Desde el menú de boceto, inserte formas predefinidas, predominantemente círculos para crear el diseño básico de las placas IChip y el área de los canales. Utilice la opción de cota para definir las cotas reales de las placas y los canales. Haga clic en Aceptar para finalizar el diseño y luego use la función de extrusión para convertir el diseño 2D en un modelo 3D del grosor deseado. Finalmente, use el menú de archivo para guardar una copia del modelo 3D en el formato de archivo de litografía fija compatible con la impresión 3D.

[Presentador] Recoja todos los artículos esenciales que se requerirán para la recolección de muestras de suelo y llegue al sitio desde donde se recolectará la muestra. Abra la aplicación móvil de geocodificación y busque la dirección única de tres palabras del sitio de muestreo y regístrela. A continuación, registre los metadatos relevantes de la muestra, como la temperatura, la fecha, la hora, la profundidad del muestreo, el clima y la exposición del sitio a los elementos. Rocíe una pala y la caja de poliestireno en la que se va a plantar el IChip con etanol al 70%. Límpialos con papel de seda y deja que el etanol se seque al aire por completo. Luego, use la pala descontaminada para limpiar cualquier residuo de la superficie, como la hojarasca o las rocas para exponer la capa superior del suelo. Descontamine la pala nuevamente como antes. Con la pala, acceda al suelo a una profundidad de tres a seis bajo la superficie y transfiera alrededor de cuatro a cinco kg de tierra desde una profundidad uniforme a la caja de poliestireno. La caja debe estar aproximadamente llena en un 75%. Transportar la tierra recolectada de regreso al laboratorio de inmediato. De la muestra de suelo recolectada, pese un gramo de suelo libre de escombros, rocas y hojarasca, en un tubo de centrífuga estéril de 50 mil que contenga 10 ml de solución salina estéril. Mezcle la tierra con la solución salina mientras hace un vórtice durante unos 10 segundos para crear una lechada de tierra. Deje el tubo de centrífuga intacto durante cinco minutos para permitir que las partículas grandes de tierra en el tubo se asienten. A continuación, transfiera con cuidado la suspensión de suciedad sobrenadante a un tubo de ensayo nuevo etiquetado como S. Utilizando la suspensión de suciedad como muestra sin diluir, realice una dilución cero transfiriendo un ml de la muestra a nueve ml de solución salina estéril en un tubo nuevo. Preparar la dilución de 10 es a potencia menos uno a 10 es potencia menos cinco. Dentro de un gabinete de bioseguridad, descontamine la placa superior, la placa inferior y la placa central del IChip sumergiéndolo en etanol al 70% durante 10 minutos. Enjuague el exceso de etanol lavando los componentes de IChip con agua desionizada estéril y déjelos secar al aire una placa de Petri estéril. Coloque la placa central del IChip en una placa de Petri estéril lista para sembrar. Derretir el medio de agar SMS en un microondas. Deje que se enfríe y luego transfiera 22,5 ml de agar SMS a 45 grados a un tubo centrífugo estéril de 50 ml. A esto, agregue 2,5 ml de una dilución adecuada de la muestra de suelo y mezcle bien mediante una inversión suave evitando la introducción de burbujas de aire. Vierta lentamente alrededor de tres a cuatro ml del medio de agar SMS sembrado sobre la placa central del IChip cubriendo toda la superficie. A continuación, deje que el medio de agar SMS se asiente durante unos cinco a 10 minutos. Compruebe si el medio de agar SMS está configurado. Luego, con la cuchilla de afeitar estéril, raspe el exceso de agar SMS de la superficie de la placa metálica IChip dejando atrás los tapones de agar en las cámaras de difusión individuales. Después de retirar la lámina protectora de uno de los filtros de membrana de policarbonato de 0,03 micrómetros, colóquela con cuidado en el interior de la cuchilla superior del IChip con unas pinzas estériles. Luego coloque otro filtro de membrana de policarbonato de 0,03 micrómetros en el lado expuesto de la placa de metal sembrada con unas pinzas estériles. Coloque las placas superior e inferior del IChip, intercalando la placa central y las membranas de policarbonato, teniendo cuidado de alinear estos orificios para tornillos en todas las placas para completar el ensamblaje del IChip. Apriete firmemente las tuercas y los pernos para asegurar el conjunto IChip. Cree una depresión más grande que el tamaño del IChip en el colector de suelo en la caja de poliestireno con una pala estéril. Plante el conjunto IChip verticalmente dentro de la depresión y empaquételo con tierra firmemente, asegurándose de que todas las superficies del IChip estén completamente cubiertas. Luego deje que se cultive in situ durante la duración deseada de dos a cuatro semanas. Durante la incubación, use agua destilada estéril para humedecer los alrededores del suelo, el IChip plantado, periódicamente para evitar que los tapones de agar SMS sembrados en la cámara de difusión se sequen. Después de la incubación deseada, desaloje suavemente la tierra alrededor del IChip plantado para recuperarlo. A continuación, lave el IChip con solución salina estéril para eliminar las partículas de suciedad adheridas y transfiéralo a una cabina de bioseguridad para su posterior procesamiento. Afloje las tuercas y los tornillos del conjunto IChip y desmonte con cuidado el IChip. Con una pinza estéril, retire las membranas de policarbonato y transfiera la placa central del IChip a la placa de Petri preparada. Utilice un aplicador de madera estéril para recuperar los tapones de agar individuales dentro de cada cámara de difusión. Inocule los tapones de agar en medios apropiados como agar SMS o agar de caldo de soja tríptico 0.1X para intentar el cultivo en laboratorio. Los aislados cultivados se pueden analizar para detectar la producción de antimicrobianos mediante métodos de rutina, como la superposición de agar utilizando cepas de prueba. Aquí mostramos resultados de cribado representativos para 12 cultivos, IC-1 a 12 obtenidos de tapones de agar IChip contra Staphylococcus aureus ATCC 29213 y Acinetobacter baumannii B8342. Tenga en cuenta que los cultivos IC-6 e IC-8 muestran actividad contra cepas de prueba grampositivas y gramnegativas, respectivamente. Alternativamente, tiña y toma imágenes de los tapones de agar recuperados que contienen bacterias recalcitrantes del suelo cultivadas in situ para confirmar el crecimiento de microcolonias en condiciones in situ. Con este enfoque, es posible recuperar bacterias recalcitrantes del suelo in situ de una manera de alto rendimiento. El IChip impreso en 3D puede acomodar 156 tapones de agar. Sin embargo, es necesario elegir la dilución correcta durante la siembra para garantizar que se siembre una célula bacteriana en cada canal del IChip. Las bacterias requeridas se pueden examinar para detectar las bioactividades deseadas, como la producción de metabolitos, la producción de enzimas, la producción de biopolímeros, etc., si se pueden cultivar en las condiciones de laboratorio. Sin embargo, también es probable que algunas bacterias no crezcan en condiciones de laboratorio y, en tales casos, es posible que tengamos que adoptar enfoques metagenómicos para darnos cuenta de la presencia microbiana y acceder a su potencial biosintético. El método descrito es muy fácil y se puede utilizar fácilmente para bioprospección de microbios en diversas condiciones ambientales con pequeñas modificaciones.