Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos
28 de febrero de 2025
Aquí, demostramos el método de caracterización de vesículas extracelulares (EV) recolectadas de fluidos biológicos, como lágrimas y saliva, de sujetos humanos. El escáner utilizado en este método es capaz de detectar el fenotipo, el tamaño y el recuento total de partículas de los EV a partir de 1 μL de la muestra.
Las vesículas extracelulares sirven como biomarcadores de enfermedades, reflejando estados fisiológicos. Nuestro enfoque permite la extracción de datos enriquecidos a partir de pequeños volúmenes de lágrimas, lo que permite avanzar en la investigación de VE en fluidos biológicos. Los desafíos experimentales clave incluyen la obtención de suficientes concentraciones de vesículas extracelulares a partir de muestras pequeñas, la minimización de la pérdida de muestras durante el aislamiento y la optimización del análisis para evitar la sobresaturación de chips o la detección de señales débiles.
Este protocolo evita los pasos de aislamiento, lo que reduce el tiempo de procesamiento, y permite el análisis de vesículas extracelulares a partir de volúmenes de muestra menores, lo que lo hace ideal para muestras biológicas limitadas, como las lágrimas. Los biomarcadores no invasivos son cruciales para la detección temprana y el tratamiento de los trastornos de la córnea. Los biomarcadores de vesículas extracelulares permiten la monitorización de enfermedades, tratamientos personalizados, un mejor cumplimiento del paciente y una mejor calidad de vida.
Nuestro laboratorio fue pionero en el análisis de vesículas extracelulares en muestras de lágrimas de sujetos con KC, identificando firmas únicas de tEV. Esto allana el camino para futuros diagnósticos y objetivos terapéuticos centrados en los vehículos eléctricos. Para comenzar, coloque las muestras biológicas y un chip de tetraspanina en el espacio de trabajo.
Pipetear 70 microlitros de muestras biológicas humanas que han sido premezcladas con la solución B de un kit de tetraspanina humana en un chip. Coloque la película en una placa de lavado de virutas para evitar la evaporación de la muestra. Después de 16 horas, coloque la placa en la lavadora de virutas.
Bloquéelo en su lugar y cierre la tapa. Pulse la opción CW-TETRA v0 en la arandela de virutas. Mientras se lavan las fichas, prepare 300 microlitros de solución de bloqueo por ficha.
Agregue 0,6 microlitros de cada anticuerpo por chip a la solución de bloqueo. Mezcle la solución de bloqueo con el cóctel de anticuerpos para garantizar una mezcla completa. Cuando se complete el lavado de la viruta, agregue 250 microlitros de la solución de bloqueo con el cóctel de anticuerpos encima de cada chip.
A continuación, cierre la tapa y pulse Continuar. Cuando la lavadora de virutas emita un chirrido, retire la placa de lavado de virutas. Mueve las fichas por la rampa.
Vuelva a colocar la placa en la arandela de virutas, asegurándose de que encaje de forma segura en su lugar. Cierre la tapa y presione Continuar. Para empezar, encienda un analizador de nanopartículas.
Inicie el programa de software de escaneo en el escritorio conectado al analizador de nanopartículas. Seleccione la carpeta de chips para elegir cada chip de tetraspanina y ubíquelo en la posición de chip en el mandril. Haga clic en los tres cuadrados debajo de la posición del chip para activar la fluorescencia.
Los cuadrados se volverán amarillos, azules y rojos. Presione la tapa del mandril y tire de ella para extraerla. A continuación, fije firmemente los chips de tetraspanina cargados con muestra en el mandril.
Alinee las clavijas de la tapa del mandril con los orificios y presione hacia abajo. Deslice la tapa para bloquearla en su lugar. A continuación, coloque el mandril en la plataforma y bloquéelo en su lugar.
A continuación, haga clic en Escanear chips en la interfaz del software, luego haga clic en Aceptar. Una vez que la etapa se mueva completamente dentro de la máquina, cierre la puerta. Una vez finalizado el escaneo, abra la puerta para expulsar la etapa y verificar los resultados. Si los escaneos fueron exitosos, deseche las fichas.
Coloque el siguiente juego de chips en el mandril. Alternativamente, devuelva el mandril vacío a la plataforma. Salga del software y apague la máquina cuando haya terminado.
Se observaron niveles óptimos de fluorescencia de las vesículas extracelulares en los canales CD63, CD81 y CD9, mientras que el canal de control MIgG permaneció negro, lo que confirma la especificidad del control. El CD81 se redujo para los fluidos biológicos. La ausencia de fluorescencia en los canales CD63, CD81 y CD9 es indicativa de ausencia de vesículas extracelulares.
La sobresaturación de fluorescencia fue evidente, lo que dificultó el discernimiento de datos significativos debido al etiquetado excesivo, particularmente en los canales CD63, CD81 y CD9.
Visión general
Este estudio presenta un método novedoso para caracterizar las vesículas extracelulares (VE) recolectadas de fluidos biológicos humanos, como lágrimas y saliva. Mediante la utilización de un chip de tetraspanin, el enfoque facilita el análisis de VE a partir de volúmenes mínimos de muestra, avanzando en el estudio de biomarcadores no invasivos para el monitoreo de enfermedades.
Componentes clave del estudio
Área de investigación
- Vesículas extracelulares
- Biomarcadores no invasivos
- Enfermedades oculares
Antecedentes
- Las VE sirven como indicadores de estados fisiológicos y enfermedades
- Los desafíos incluyen bajas concentraciones en muestras pequeñas y tiempo de procesamiento de muestras
- Importancia de la detección temprana de trastornos corneales
Métodos utilizados
- Uso de un chip de tetraspanin para el análisis de VE
- Muestras biológicas humanas (lágrimas)
- Detección basada en fluorescencia de marcadores de VE CD63, CD81 y CD9
Principales resultados
- La integración de los pasos de preparación y análisis de muestras reduce el tiempo de procesamiento
- Los niveles de fluorescencia de los marcadores de VE confirmaron la especificidad y presencia
- Identificación de firmas de tEV en muestras de lágrimas de sujetos con queratocono
Conclusiones
- Este método proporciona un enfoque simplificado para el análisis de VE a partir de muestras biológicas pequeñas
- Los hallazgos respaldan diagnósticos futuros y objetivos terapéuticos en salud ocular
Preguntas frecuentes
Executive Industry Relevance
Characterizing extracellular vesicles (EVs) from minimal biological fluid volumes addresses a critical bottleneck in non-invasive biomarker discovery and disease monitoring. This workflow enables high-content EV phenotyping from scarce patient samples, supporting translational research and early-stage target validation. The approach enhances predictive confidence for biomarker-driven portfolio decisions in ocular and systemic disease pipelines.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of EV-based biomarkers for disease-relevant pathway analysis.
- Supports functional target validation by quantifying EV phenotypes from patient-derived fluids.
- Facilitates mechanistic de-risking by linking EV signatures to physiological states.
Screening & Assay Development
- Prepares validated EV detection systems for downstream screening workflows.
- Delivers quantitative, reproducible EV marker measurements from as little as 1 μL of sample.
- Standardizes assay conditions to minimize sample loss and maximize data quality.
Translational & Preclinical Research
- Aligns non-invasive EV biomarker analysis with disease monitoring strategies.
- Enables continuity from discovery to preclinical validation using patient-derived fluids.
- Supports risk-adjusted advancement of biomarker-driven therapeutic hypotheses.
Pipeline & Workflow Integration
This EV characterization protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum, bridging early biomarker identification with translational validation in limited-sample contexts.
- Discovery Biology: Provides robust hypothesis testing for EV biomarker relevance in disease states.
- Screening: Offers reproducible, quantitative EV marker readouts for assay development.
- Analytics: Delivers particle count, size, and phenotype data to compare biological conditions.
- Translational Research: Connects non-invasive sample analysis to preclinical biomarker validation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable platform for EV analysis across diverse biological fluids.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in EV biomarker discovery and target validation.
- Operational Value: Reduces sample requirements and processing time while enhancing reproducibility.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions for biomarker-driven programs and reduces late-stage risk.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of non-invasive biomarker assets.
Implementation Considerations
- Requires expertise in EV biology and fluorescence-based detection systems.
- Needs access to nanoparticle analyzers and tetraspanin chip technology.
- Demands cross-team standardization for sample handling and data interpretation.
- Adaptable to various biological fluids with protocol optimization.
- Potential limitations include chip oversaturation and signal detection thresholds.
