Name: Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T13:30:00.000+00:00
Duration: 5 min 7 s
Description: Aprenda a caracterizar vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos humanos utilizando un chip de tetraspanina. Este método optimiza el análisis de muestras mínimas para biomarcadores no invasivos.

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<table><tbody><tr><td>ChipWasher 100</td><td>NanoView</td><td>EV-CW100</td><td>Incuba, lava, enjuaga y seca las virutas de tetraspanina. Este modelo actual ya no está disponible. Precio al momento de la compra: $9,995.00&nbsp;</td></tr><tr><td>El software ExoView Analyzer</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>analiza la información del chip y produce archivos de Excel para su posterior análisis. Ya no está disponible.</td></tr><tr><td>ExoView R100</td><td>NanoView</td><td>EV-R100</td><td>Se utiliza para escanear los chips de tetraspanina a 3 longitudes de onda. Este modelo actual ya no está disponible. Precio en el momento de la compra:&nbsp; $110,000.00</td></tr><tr><td>Software ExoView Scanner</td><td>NanoView</td><td>N/A</td><td>Escanea los chips en 3 longitudes de onda diferentes. Ya no está disponible.</td></tr><tr><td>Kits de Tetraspanin Humano</td><td>Unchained Labs</td><td>EV-TETRA-C</td><td>Incluye 8 chips de tetraspanina, solución de incubación, solución de bloqueo, anticuerpo CD63, anticuerpo CD81, anticuerpo CD9, solución A, solución B, USB y cubierta de placa.</td></tr></tbody></table>

caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

Characterizing Extracellular Vesicles from Biological Fluids

Al analizar los puntos en los chips, apunte a una concentración óptima de EV observando EV marcados con fluorescencia en los canales CD63, CD81 y CD9, y el canal MIgG30,91 debe permanecer negro, ya que este es el canal de control como se ve en la Figura 3A. CD81 se reducirá para los fluidos biológicos. Si no hay fluorescencia en los canales CD63, CD81 y CD9, hay ausencia de EV (Figura 3B). Tenga cuidado de no saturar demasiado el chip (Figura 3C). Esto dificultará que el software de análisis calcule la precisión del tamaño, el recuento total de partículas y los fenotipos de los EV. A partir de los puntos de la concentración óptima, el software de análisis podrá medir el tamaño (50-200 nm), el recuento total de partículas y la expresión de tetraspanina de los EV (Figura 4) y se exportará a hojas de cálculo individuales para su posterior análisis. El análisis de tetraspanina incluirá la colocalización de las proteínas de superficie en los EV. La colocalización se representará con un "/", por ejemplo, "CD63/CD81". Esto no significa que CD63 y CD81 estén combinados; significa que tanto el CD63 como el CD81 se encuentran en la superficie del vehículo eléctrico.
Estos resultados proporcionarán información valiosa entre muestras sanas y enfermas. Podremos determinar si las muestras sanas o las muestras enfermas producen más VEs, VE más grandes o más pequeñas, y el fenotipo de las VEs. Cualquiera o todas estas características podrían desempeñar un papel en la biogénesis y/o progresión de la enfermedad. Con estos resultados, podremos ver si hay una ausencia o un aumento de los niveles de tetraspanina, lo que puede proporcionar información sobre los procesos celulares y la formación de EV.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig1.jpg"> 
Figura 1: Los tipos y tamaños de los diferentes vehículos eléctricos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig2.jpg"> 
Figura 2: Esquema de cómo los chips de tetraspanina capturan y detectan los EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig2large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig3.jpg"> 
Figura 3: Optimización de las concentraciones de vehículos eléctricos. (A) Concentración óptima de vehículos eléctricos. (B) Resultado negativo: no hay vehículos eléctricos presentes. (C) Sobresaturación de vehículos eléctricos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig3large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67699/67699fig4.jpg"> 
Figura 4: Datos generados por el analizador de nanopartículas. (A) Tamaño del diámetro EV medido en nanómetros. (B) Recuento total de partículas de los vehículos eléctricos. (C) Fenotipo colocalizado EV. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67699/67699fig4large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Técnica</td>
			<td>Ventajas</td>
			<td>Limitaciones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ultracentrífuga</td>
			<td>Alta pureza42,43</td>
			<td>Cambios en la morfología del EV42,44</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Homogeneidad42,45</td>
			<td>Requiere gran volumen42,44,46</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Funcionalidad42,43</td>
			<td>Caro42,43</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Citometría de flujo</td>
			<td>Evalúe muestras en múltiples puntos de tiempo47</td>
			<td>Señal débil48,49</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Múltiples puntos finales47,50</td>
			<td>Poros obstruidos51</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Análisis de EV individual de alto rendimiento52,53</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Centrifugación en gradiente de densidad</td>
			<td>Producir muestras de alta pureza54</td>
			<td>Laboriosa55,56</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Variedad de muestras55,57</td>
			<td>Consumo de tiempo55,58 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Pérdida significativa de rendimiento54</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Precipitación</td>
			<td>Sencillo59,60</td>
			<td>Contaminación36,44,61</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rápido61,62</td>
			<td>Inespecífico63</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Alto rendimiento44,59,62</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>pH neutro36</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Filtración</td>
			<td>Simple64 </td>
			<td>Trampa de exosomas65</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Rápido64</td>
			<td>Daña las vesículas grandes36</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Barato64</td>
			<td>Torta de filtración66,67</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>Obstrucción de exosomas65</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Ventajas y limitaciones de las técnicas de aislamiento de VE. Una lista de las diversas formas de aislar los vehículos eléctricos, incluidas sus ventajas y limitaciones.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Técnica</td>
			<td>Ventajas</td>
			<td>Limitaciones</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dispersión dinámica de la luz</td>
			<td>Mida partículas de tamaño que oscilan entre 1 nm y 6 μM78 </td>
			<td>No es adecuado para medir muestras complejas de exosomas con un amplio rango de tamaños79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>El límite inferior es de 10 nm, adecuado para sistemas monodispersos79 </td>
			<td>No es capaz de distinguir las proteínas contaminadas de los exosomas79</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscopía electrónica de transmisión (TEM)</td>
			<td>Observar la morfología de los exosomas79,80 </td>
			<td>Complicadas preparaciones de muestras79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Observar la estructura interna81 </td>
			<td>No es capaz de distinguir exosomas en función del tamaño y la forma debido a señales de fluorescencia exageradas82 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Análisis de seguimiento de nanopartículas</td>
			<td>Mida la concentración, el tamaño y la distribución del tamaño de los exosomas en el rango de 10 nm a 2 μM78 </td>
			<td>No puede diferenciar los VE de los agregados de proteínas y otros contaminantes83 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2"></td>
			<td>Preparación y medición rápida de muestras78,84</td>
			<td>Costoso instrumento NTA85 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Las muestras se pueden recuperar en forma nativa84 </td>
			<td>Sensible a las vibraciones85</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Western Blot (WBs)</td>
			<td>puede analizar cualitativa y cuantitativamente proteínas marcadoras79,86 </td>
			<td>Complicado y lento79 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Análisis de exosomas a partir de medios de cultivo celular79 </td>
			<td>Los aislados de EV pueden contener lipoproteínas y otros contaminantes86 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Citometría de flujo</td>
			<td>Mayor sensibilidad e imágenes de alta resolución para</td>
			<td rowspan="2">Laborioso y laborioso con límite de detección de 400 nm79,88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Distinguir los exosomas teñidos de las contenciones87 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Baja concentración de muestra requerida79 </td>
			<td>Las señales ópticas dificultan la precisión y la resolución88 </td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Exoview</td>
			<td>Medición de tetraspaninas (CD9, CD63 y CD81) en exosomas89 </td>
			<td>No mide tamaños EV más grandes75</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>Mide las proteínas de carga de los vehículos eléctricos90</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 2: Ventajas y limitaciones de las técnicas de caracterización de VE.

Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

Extracellular vesicles (EVs) are structures that are produced from cells and participate in intercellular communication by transporting biomolecules from ...

Las vesículas extracelulares sirven como biomarcadores de enfermedades, reflejando estados fisiológicos. Nuestro enfoque permite la extracción de datos enriquecidos a partir de pequeños volúmenes de lágrimas, lo que permite avanzar en la investigación de VE en fluidos biológicos. Los desafíos experimentales clave incluyen la obtención de suficientes concentraciones de vesículas extracelulares a partir de muestras pequeñas, la minimización de la pérdida de muestras durante el aislamiento y la optimización del análisis para evitar la sobresaturación de chips o la detección de señales débiles.Este protocolo evita los pasos de aislamiento, lo que reduce el tiempo de procesamiento, y permite el análisis de vesículas extracelulares a partir de volúmenes de muestra menores, lo que lo hace ideal para muestras biológicas limitadas, como las lágrimas. Los biomarcadores no invasivos son cruciales para la detección temprana y el tratamiento de los trastornos de la córnea. Los biomarcadores de vesículas extracelulares permiten la monitorización de enfermedades, tratamientos personalizados, un mejor cumplimiento del paciente y una mejor calidad de vida.Nuestro laboratorio fue pionero en el análisis de vesículas extracelulares en muestras de lágrimas de sujetos con KC, identificando firmas únicas de tEV. Esto allana el camino para futuros diagnósticos y objetivos terapéuticos centrados en los vehículos eléctricos. Para comenzar, coloque las muestras biológicas y un chip de tetraspanina en el espacio de trabajo.Pipetear 70 microlitros de muestras biológicas humanas que han sido premezcladas con la solución B de un kit de tetraspanina humana en un chip. Coloque la película en una placa de lavado de virutas para evitar la evaporación de la muestra. Después de 16 horas, coloque la placa en la lavadora de virutas.Bloquéelo en su lugar y cierre la tapa. Pulse la opción CW-TETRA v0 en la arandela de virutas. Mientras se lavan las fichas, prepare 300 microlitros de solución de bloqueo por ficha.Agregue 0,6 microlitros de cada anticuerpo por chip a la solución de bloqueo. Mezcle la solución de bloqueo con el cóctel de anticuerpos para garantizar una mezcla completa. Cuando se complete el lavado de la viruta, agregue 250 microlitros de la solución de bloqueo con el cóctel de anticuerpos encima de cada chip.A continuación, cierre la tapa y pulse Continuar. Cuando la lavadora de virutas emita un chirrido, retire la placa de lavado de virutas. Mueve las fichas por la rampa.Vuelva a colocar la placa en la arandela de virutas, asegurándose de que encaje de forma segura en su lugar. Cierre la tapa y presione Continuar. Para empezar, encienda un analizador de nanopartículas.Inicie el programa de software de escaneo en el escritorio conectado al analizador de nanopartículas. Seleccione la carpeta de chips para elegir cada chip de tetraspanina y ubíquelo en la posición de chip en el mandril. Haga clic en los tres cuadrados debajo de la posición del chip para activar la fluorescencia.Los cuadrados se volverán amarillos, azules y rojos. Presione la tapa del mandril y tire de ella para extraerla. A continuación, fije firmemente los chips de tetraspanina cargados con muestra en el mandril.Alinee las clavijas de la tapa del mandril con los orificios y presione hacia abajo. Deslice la tapa para bloquearla en su lugar. A continuación, coloque el mandril en la plataforma y bloquéelo en su lugar.A continuación, haga clic en Escanear chips en la interfaz del software, luego haga clic en Aceptar. Una vez que la etapa se mueva completamente dentro de la máquina, cierre la puerta. Una vez finalizado el escaneo, abra la puerta para expulsar la etapa y verificar los resultados. Si los escaneos fueron exitosos, deseche las fichas.Coloque el siguiente juego de chips en el mandril. Alternativamente, devuelva el mandril vacío a la plataforma. Salga del software y apague la máquina cuando haya terminado.Se observaron niveles óptimos de fluorescencia de las vesículas extracelulares en los canales CD63, CD81 y CD9, mientras que el canal de control MIgG permaneció negro, lo que confirma la especificidad del control. El CD81 se redujo para los fluidos biológicos. La ausencia de fluorescencia en los canales CD63, CD81 y CD9 es indicativa de ausencia de vesículas extracelulares.La sobresaturación de fluorescencia fue evidente, lo que dificultó el discernimiento de datos significativos debido al etiquetado excesivo, particularmente en los canales CD63, CD81 y CD9.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Las vesículas extracelulares presentes en la sangre han sido sugeridas como nuevos biomarcadores para diversas enfermedades. En este trabajo se presenta un protocolo para el aislamiento de grandes microvesículas derivadas de membrana plasmática a partir de muestras de sangre periférica y su posterior análisis mediante citometría de flujo convencional y Western Blotting.

Aislamiento y caracterización de microvesículas de la sangre periférica

En este protocolo, se describe el flujo de trabajo completo para el aislamiento rápido de vesículas extracelulares de sangre humana y caracterización de marcadores específicos por análisis de seguimiento de nanopartículas basada en fluorescencia. Los resultados presentados muestran un alto nivel de reproducibilidad y pueden regularse en sobrenadantes de cultivo celular.

Caracterización basada en fluorescencia rápida de solo vesículas extracelulares en la sangre humana con el análisis de seguimiento de nanopartículas

El protocolo describe un método reproducible diseñado para uso con sobrenadantes de cultivo celular para detectar epítopos superficiales en pequeñas vesículas extracelulares (EV). Utiliza específica inmunoprecipitación EV usando granos juntados con los anticuerpos que reconocen antígenos de superficie CD9, CD63 y CD81. El método está optimizado para el análisis de citometría de flujo aguas abajo.

Análisis Cytometric del vesículas extracelulares de medios acondicionado de célula de flujo

Presentamos un protocolo detallado para aislar pequeñas vesículas extracelulares (EVs) de tejidos todo, incluyendo a muestras de cerebro y del tumor. Este método ofrece una técnica reproducible para extraer EVs de tejido sólido para mayores análisis aguas abajo.

Extracción de vesículas extracelulares de todo tejido

El presente informe destaca los requisitos cronológicos para el aislamiento de vesículas extracelulares (EV) de la microglia o de los macrófagos sanguíneos. Los vehículos eléctricos derivados de la microglia se evaluaron como reguladores del crecimiento de la neurita, mientras que los vehículos eléctricos derivados de macrófagos sanguíneos se estudiaron en el control de la invasión de células de glioma C6 en ensayos in vitro. El objetivo es comprender mejor estas funciones EV como mediadores...

Caracterización de vesículas extracelulares derivadas de células inmunes y estudio del impacto funcional en el entorno celular

El protocolo aquí demuestra que las vesículas extracelulares pueden separarse adecuadamente de los medios de cultivo celular condicionados utilizando cromatografía de exclusión de tamaño.

Cromatografía de exclusión de tamaño para separar vesículas extracelulares de medios de cultivo celular condicionados

El presente protocolo describe un método para extraer vesículas extracelulares de la sangre periférica y tejidos sólidos con el posterior perfil de antígenos de superficie y cargas de proteínas.

Aislamiento y análisis de vesículas extracelulares trazables y funcionalizadas a partir del plasma y tejidos sólidos

La última generación de herramientas de caracterización de EV es capaz de realizar un solo análisis de EV a través de múltiples parámetros simultáneamente. La citometría de nanoflujo mide todas las partículas biológicas mayores de 45 nm sin etiquetado e identifica características específicas de subpoblaciones mediante una variedad de técnicas de etiquetado fluorescente.

Caracterización de proteínas transmembrana de vesícula extracelular única mediante citometría de nanoflujo

Este artículo describe una metodología para el aislamiento, caracterización y cuantificación de vesículas extracelulares (EV) derivadas del plasma humano y presenta un flujo de trabajo para el análisis sin etiquetas del proteoma EV utilizando cromatografía líquida-espectrometría de masas en tándem (LC-MS/MS).

Aislamiento, caracterización y análisis proteómico de vesículas extracelulares derivadas del plasma para el descubrimiento de biomarcadores cardiovasculares

Este protocolo proporciona una descripción detallada de la clasificación de las vesículas extracelulares (VE) liberadas por las células estromales mesenquimales. En particular, se centra en el ajuste del instrumento y la optimización de las condiciones de clasificación. El objetivo es clasificar las vesículas extracelulares preservando sus características.

Establecer una clasificación exitosa para el aislamiento de vesículas extracelulares

Aprenda a caracterizar vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos humanos utilizando un chip de tetraspanina. Este método optimiza el análisis de muestras mínimas para biomarcadores no invasivos.

Caracterización de vesículas extracelulares a partir de fluidos biológicos

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