Visualización de la dinámica microbiana del ciclo del metano en los humedales costeros

Este estudio coincidió visualmente con la distribución espacial y temporal de los genes microbianos clave del ciclo del metano en los humedales costeros del sur de Texas, explora cómo los factores ambientales regulan la dinámica del metano. Nuestros hallazgos revelan que la abundancia de genes del ciclo del metano en los humedales costeros del sur de Texas es sensible a las condiciones ambientales, incluida la salinidad y la estación. En particular, mmoX, un tipo de gen de metano monooxigenasa, es más abundante en estaciones más frías.

Este protocolo aborda la investigación en la detección de genes microbianos que ciclan el metano al ofrecer herramientas novedosas para visualizar la dinámica microbiana espacial y estacional influenciada por factores ambientales. Al integrar métodos de PCR optimizados con visualización GIS, este protocolo proporciona una detección mejorada y un mapeo espacial de genes que ciclan el metano al tiempo que captura patrones microbianos dinámicos, espaciales y estacionales influenciados por factores ambientales.

[Narrador] Para comenzar, prepare una mezcla de reacción de cPCR de 25 microlitros con el eDNA y otros componentes. Coloque los tubos en la máquina de PCR y ejecute la reacción de cPCR con los parámetros apropiados. Después de la cPCR, prepare la mezcla de reacción qPCR que contiene verde cibernético, excluyendo el ADN molde. Dispense 57 microlitros de la mezcla de reacción preparada en cada tubo de PCR. Agregue 3 microlitros de ADN molde, agua estándar o sin nucleasas a cada tubo y golpee suavemente el tubo para mezclar. Alícuota de 20 microlitros de la mezcla de reacción preparada de cada tubo en pocillos designados de una placa de qPCR de 96 pocillos. Selle la placa de PCR con una película adhesiva de sellado de PCR con un aplicador. Y centrifugarlo a 1.000 x g durante un minuto para asegurar una mezcla adecuada y eliminar cualquier burbuja dentro de los pocillos. Coloque la placa de PCR en el termociclador. Encienda la máquina qPCR y abra el software relacionado para configurar el protocolo. Configure el programa qPCR e inicie la ejecución. Abra el software del sistema de información geográfica, ArcGIS Pro, y guarde el archivo de proyecto con el nombre Área de estudio en la carpeta especificada en el equipo. Haga clic en Mapa, seleccione Mapa base y elija el terreno con etiquetas como mapa base. Haga clic en Localizar y, a continuación, haga clic en Buscar. Cuando se abra la barra de búsqueda, escriba el nombre del área de estudio para ubicarla en el mapa. Para dibujar el área específica mediante la georreferenciación, haga clic en Ver y, a continuación, en Panel de catálogo en la capa superior. Haga doble clic en la carpeta del catálogo y seleccione el nombre de archivo requerido. Haga clic con el botón derecho en el archivo .gdb de la geodatabase. Haga clic en Nuevo y seleccione Clase de entidad. A continuación, aparecerá la ventana Crear clase de entidad. Escriba el cuadro Nombre y Alias y haga clic en Finalizar en la parte inferior. Ahora, haga clic en Ver, seguido de Contenido. El nombre del alias aparecerá en el panel Contenido. Haga clic en Editar en la capa superior, seguido de Crear. Se abrirá el panel Crear entidades. Haga doble clic en el alias en el panel Crear entidades y aparecerán las opciones Configurar comentarios de la herramienta. Seleccione líneas y, a continuación, dibuje líneas en el mapa para crear el límite del área de estudio. Haga doble clic en el mapa para finalizar. Minimice el software SIG y abra una hoja de cálculo. Escriba el nombre de la muestra en la primera columna, la latitud en la segunda columna y la longitud en la tercera columna. Utilice las siguientes cuatro columnas para los datos de qPCR de pmoA1, pmoA2, mmoX y mcrA. Guarde el archivo en formato CSV en una carpeta específica del equipo. A continuación, abra el software SIG y haga clic en Agregar datos, seguido de Datos de puntos XY. Seleccione el archivo CSV guardado de la carpeta en el cuadro Tabla de entrada. Cambie el nombre del archivo en el cuadro Clase de entidad de salida y haga clic en Ejecutar para mostrar los puntos de muestreo en el mapa. Ahora, haga clic en la barra de búsqueda en la parte superior y busque Kriging. Seleccione el archivo de la estación de muestreo y elija pmoA1. A continuación, haga clic en el entorno, seleccione la estación de muestreo en la capa y la máscara y haga clic en Ejecutar. Para crear un diseño del mapa, haga clic en Insertar, Nuevo diseño y seleccione ANSI-Landscape. Haga clic en Marco de mapa, seleccione el mapa con kriging y coloque todos los mapas en el diseño dibujando rectángulos. Seleccione Flecha de norte y colóquela en el diseño para indicar la dirección norte. A continuación, seleccione Barra de escala para mostrar la escala del área en el mapa. Haga clic en Leyenda, luego colóquelo en el diseño para mostrar las leyendas del mapa. Haga clic en Cuadrícula, luego seleccione cualquier opción de retícula negra para crear una cuadrícula con latitud y longitud. La cuadrícula aparecerá en el panel Contenido con la etiqueta Retícula de etiqueta horizontal negra. Haga doble clic en Retícula de etiqueta horizontal negra, seleccione Componentes y elimine las marcas 1 y la cuadrícula haciendo clic en el signo de cruz a su derecha. Finalmente, haga clic en Compartir en la capa superior, luego haga clic en Exportar diseño. Seleccione el tipo de archivo como PDF, guarde el archivo en el equipo con el cuadro Nombre, establezca la resolución vertical en 500 PPP y haga clic en Exportar para crear el archivo PDF del mapa. El análisis de cPCR reveló variabilidad espacial en la detección de genes relacionados con el ciclo del metano, con genes mcrA detectados en todas las muestras LB y RV, pero ausentes en las muestras de BC, lo que vincula la salinidad con la distribución del metanógeno. La cPCR mostró bandas más brillantes para pmoA1 con pares de cebadores A189-mb661, confirmando una abundancia baja pero detectable en muestras de VD, mientras que estaba ausente en LB y BC. El análisis de qPCR mostró una alta variación estacional, con los genes mmoX más abundantes durante la estación fría y pmoA1 más abundantes durante la estación cálida.