Name: Detección de ampollas nucleares y fugas de ADN en células de mamíferos mediante inmunofluorescencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-17T14:45:00.000+00:00
Duration: 6 min 23 s
Description: Aprende a detectar ampollas nucleares y fugas de ADN en células HeLa mediante inmunofluorescencia. Este método permite estudiar laminopatías como el síndrome de progeria y su impacto en la reparación del ADN.

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<ol><li>Navarro, C. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+ZMPSTE24+%28FACE1%29+mutations+in+patients+affected+with+restrictive+dermopathy+or+related+progeroid+syndromes+and+mutation+update%5BTitle%5D)+AND+%22Eur+J+Hum+Genet%22%5BJournal%5D)">New ZMPSTE24 (FACE1) mutations in patients affected with restrictive dermopathy or related progeroid syndromes and mutation update.</a> Eur J Hum Genet. 22 (8), 1002-1011 (2014).</li>
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<li>Pande, S., Ghosh, D. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nuclear+proteostasis+imbalance+in+laminopathy-associated+premature+aging+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22FASEB+J%22%5BJournal%5D)">Nuclear proteostasis imbalance in laminopathy-associated premature aging diseases.</a> FASEB J. 37 (8), 1025-1035 (2023).</li>
<li>Odell, I. D., Cook, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immunofluorescence+techniques%5BTitle%5D)+AND+%22J+Invest+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Immunofluorescence techniques.</a> J Invest Dermatol. 133 (4), 1-12 (2013).</li>
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<li>Gunn, A. L., Yashchenko, A. I., Dubrulle, J., Johnson, J., Hatch, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+high-content+screen+reveals+new+regulators+of+nuclear+membrane+stability%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">A high-content screen reveals new regulators of nuclear membrane stability.</a> Sci Rep. 14, 6013(2024).</li>
<li>Yu, L., Liu, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cytosolic+DNA+sensing+by+cGAS%3A+Regulation%2C+function%2C+and+human+diseases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cytosolic DNA sensing by cGAS: Regulation, function, and human diseases.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 6 (170), 1-14 (2021).</li>
<li>Odinammadu, K. O., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+farnesyl+transferase+inhibitor+%28FTI%29+lonafarnib+improves+nuclear+morphology+in+ZMPSTE24-deficient+fibroblasts+from+patients+with+the+progeroid+disorder+MAD-B%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleus%22%5BJournal%5D)">The farnesyl transferase inhibitor (FTI) lonafarnib improves nuclear morphology in ZMPSTE24-deficient fibroblasts from patients with the progeroid disorder MAD-B.</a> Nucleus. 14 (1), 1-14 (2023).</li>
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La lámina nuclear es una red de filamentos que subyace a la membrana nuclear y está formada por proteínas llamadas laminas. La lámina nuclear desempeña un papel esencial en la arquitectura nuclear, el posicionamiento de los poros nucleares, la regulación de la expresión génica, la organización de la cromatina, la replicación del ADN y la reparación del ADN 1,2,3. Las mutaciones en los genes que desempeñan un papel en la expresión de las proteínas lamina conducen a trastornos genéticos llamados laminopatías3.
La dermopatía restrictiva (RD) es un trastorno grave de la laminopatía causada principalmente por mutaciones heterocigóticas compuestas que crean codones de terminación prematura en el genZMPSTE24 4, lo que conduce a la ausencia de la metaloproteasa ZMPSTE24. Esta laminopatía se caracteriza por retraso del crecimiento intrauterino, piel tensa y rígida, boca de tamaño pequeño, pelo fino y defectos de mineralización ósea1. Los pacientes con RD generalmente no viven más allá de su primera semana de vida debido a la insuficiencia pulmonar1. Otros dos trastornos de la laminopatía conocidos como síndrome de progeria atípico de Hutchinson-Gilford (AT-HGPS) y displasia mandibuloacral tipo B (MAD-B) implican una expresión ZMPSTE24 reducida y se asocian con una menor esperanza de vida y muestran similitudes con los trastornos del envejecimiento prematuro5. La proteasa ZMPSTE24 que se ve afectada en estas laminopatías es vital en la modificación postraduccional de la lámina A, que es un componente crítico de la lámina nuclear. ZMPSTE24 deficiencia da lugar a la acumulación de una forma farnesilada procesada incompletamente de la lamina A, conocida como prelamina A2.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig1.jpg"> 
Figura 1: Procesamiento de Lamin A en normal vs. Células RD. Vía de procesamiento de la lamina A en células normales (izquierda) y procesamiento alterado de la lamina A en células RD, o deficientes en ZMPSTE (derecha). Los grupos farnesilo (Fa) y metilo (Me) están indicados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67719/67719fig1large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Como se ve en la Figura 1, en el procesamiento normal de la lamina A, un grupo farnesilo (lípido) se une a un residuo de cisteína cerca del extremo C-terminal, seguido de una escisión proteolítica de tres aminoácidos C-terminales 3,6. A continuación, el residuo de cisteína se metila. Estas dos modificaciones permiten que la prelamina A se dirija a la membrana nuclear interna2. A continuación, ZMPSTE24 lleva a cabo una reacción de escisión en la que los últimos 15 aminoácidos C-terminales, junto con los grupos farnesilo y metilo, se eliminan para producir la proteína Lamin A madura, que se entrega a la lámina nuclear 6,7,8. En RD, AT-HGPS y MAD-B, el paso final del procesamiento no ocurre de manera efectiva ya que la metaloproteinasa ZMPSTE24 está ausente o no es completamente funcional 8,9. Esto da lugar a la acumulación de prelamina A, que permanece permanentemente farnesilada y metilada9. Estos últimos grupos hacen que la prelamina A se adhiera a la membrana nuclear interna en lugar de localizarse en la lámina nuclear, donde debería residir en última instancia la lámina A madura, como se ve en la Figura 1. Por lo tanto, la deficiencia de ZMPSTE tiene efectos profundos en una variedad de funciones nucleares, junto con la estructura nuclear10,11,12,13,14,15. Estas alteraciones de la estructura nuclear pueden incluir la formación de burbujas nucleares e incluso la ruptura nuclear, que puede dar lugar a la fuga de ADN en el citosol, así como a la entrada de citosol en el núcleo. Los núcleos de forma aberrante son, de hecho, un sello distintivo de los trastornos de laminopatía, junto con muchos otros fenotipos que son causados por un procesamiento defectuoso de la prelamina A16,17. Los defectos en la lámina nuclear conducen a una multitud de impactos perjudiciales, incluida la mala localización del control de calidad de las proteínas nucleares y las proteínas de reparación del ADN en el nucleoplasma, lo que, a su vez, da lugar a numerosos defectos en la función nuclear18. Es importante contar con una técnica sencilla que pueda ayudar a identificar y monitorizar estas características distintivas de las laminopatías para facilitar la investigación en el desarrollo de enfoques terapéuticos destinados a mejorar los fenotipos de las laminopatías. En ratones con laminopatías, se ha demostrado que la eliminación de la ampolla nuclear se correlaciona con la eliminación generalizada de los fenotipos de laminopatía16. Una técnica que permite monitorear la integridad nuclear en células humanas podría mejorar el estudio de posibles tratamientos para eliminar o mejorar significativamente los fenotipos de enfermedades.
La inmunofluorescencia indirecta (FI) es una técnica sensible y ampliamente utilizada que utiliza tanto un anticuerpo primario no marcado como un anticuerpo secundario marcado con fluoróforos que reconoce el anticuerpo primario para detectar un objetivo de interés19. Los métodos de FI pueden proporcionar un medio poderoso para visualizar componentes y estructuras intracelulares específicas. También es posible que más de una molécula de anticuerpo secundario pueda interactuar con el anticuerpo primario, lo que resulta en la amplificación de la señal19. La FI indirecta es una técnica versátil que también permite la detección de múltiples anticuerpos primarios con un conjunto relativamente pequeño de anticuerpos secundarios, ya que los anticuerpos secundarios se elevan contra el dominio Fc del anticuerpo primario, que se conserva dentro de la especie19.
En este artículo se describe un método indirecto (IF) para evaluar la formación de burbujas nucleares y la fuga de ADN en células deficientes en ZMPSTE24, utilizando anticuerpos contra el ADN bicatenario (dsDNA) y la lamina B1 para detectar el ADN y la lámina nuclear, respectivamente. Para demostrar la utilidad de este enfoque, el procedimiento se aplicó a una línea celular HeLa con expresión de ZMPSTE24 knock-out, así como a una línea celular HeLa que expresa ZMPSTE24, y se compararon los resultados de las dos líneas celulares.

<table><tbody><tr><td>Cubreobjetos de vidrio cuadrados de 22 mm</td><td>Propper Manufacturing Company</td><td>M8710</td><td>Se puede usar cualquier tamaño o forma, siempre que se puedan fijar a un portaobjetos de microscopio estándar.</td></tr><tr><td>36.5% Formaldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F8775</td><td>Reactivo de fijación.</td></tr><tr><td>75 cm 2 Matraces</td><td>Corning</td><td>430725U</td><td>Para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Suero bovino Albinum (BSA)</td><td>Fisher Scientific</td><td>9048-46-8</td><td>Tampón de dilución de anticuerpos.&nbsp;</td></tr><tr><td>DMEM con 1 g/L de glucosa, L-glutamina y piruvato de sodio</td><td>Corning</td><td>10-014-CV</td><td>Para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Etanol (200 Proof)</td><td>Decon Laboratories</td><td>2701</td><td>Para la deshidratación de muestras antes del montaje, diluidas para hacer múltiples concentraciones.</td></tr><tr><td>Microscopio digital de fluorescencia invertida EVOS FL</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-563-460</td><td>Imaging.</td></tr><tr><td>Gelatina de pescado</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G7041</td><td>Tampón de dilución de anticuerpos.</td></tr><tr><td>Fluoromount-G</td><td>Southern Biotech</td><td>0100-01</td><td>Medio de montaje para evitar el fotoblanqueo.</td></tr><tr><td>Parafilm (4 pulgadas)</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-374-12</td><td>Se puede sustituir cualquier tamaño, siempre y cuando quepan los cubreobjetos que se utilizan.</td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15-140-122</td><td>Para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Fabricada y esterilizada en el laboratorio para cultivo de tejidos y soluciones.</td></tr><tr><td>Suero fetal bovino de primera calidad (FBS)</td><td>Atlanta Biologicals</td><td>S11150</td><td>Para cultivo celular.&nbsp;</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio Superfrost Premium</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-544-7</td><td>Se puede utilizar cualquier portaobjetos de microscopio estándar.</td></tr><tr><td>Placas de fondo plano de 6 pocillos tratadas con cultivo de tejidos</td><td>Falcon</td><td>353046</td><td>para cultivo celular.</td></tr><tr><td>TritonX-100</td><td>Thermofisher Scientific</td><td>A16046. AP</td><td>Para lavar.</td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0,5%)</td><td>Gibco</td><td>15-400-054</td><td>Para cultivo celular.</td></tr><tr><td>Tween 20</td><td>Fisher Scientific</td><td>9005-64-5</td><td>Reactivo de permeación celular.</td></tr></tbody></table>

detección de ampollas nucleares y fugas de adn en células de mamíferos mediante inmunofluorescencia

Detection of Nuclear Blebbing and DNA Leakage in Mammalian Cells by Immunofluorescence

Este estudio presenta un método de FI para visualizar la lámina nuclear en conjunción con el ADN bicatenario (dsDNA). Una vez que se realiza la FI, las imágenes capturadas se pueden examinar en busca de signos de ampollas nucleares y fugas de ADN.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67719/67719fig2.jpg"> 
Figura 2: Ampolla nuclear en células HeLa CT y <...

Detección de ampollas nucleares y fugas de ADN en células de mamíferos mediante inmunofluorescencia

The nuclear lamina is a network of filaments underlying the nuclear membrane, composed of lamins and lamin-associated proteins. It plays critical roles in ...

detection-nuclear-blebbing-dna-leakage-mammalian-cells

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Investigación

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Biology

Biología

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Supervisión de la replicación del plásmido en células de mamíferos en vivo durante varias generaciones por microscopía de fluorescencia

En este video, describimos el método de inmunofluorescencia para visualizar la localización de las proteínas de reparación del ADN γH2AX y 53BP1 en los sitios de roturas de ADN de doble cadena en núcleos celulares irradiados.

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Microscopía de inmunofluorescencia para el análisis de roturas de doble cadena de ADN

Este manuscrito describe una técnica novedosa que permite la detección de la expresión génica intracelular después de la endocitosis de nanopartículas marcadas con fluorescencia directamente en células vivas. El método no requiere manipulación de las células y no está restringido con respecto al gen o especie objetivo.

La detección de Intracelular expresión génica en células vivas de murino, humano y porcino Origen Utilizando nanopartículas fluorescencia marcado

Aquí se demuestra cómo se puede usar el Ensayo de Ligación de Proximidad in situ (PLA) para detectar y visualizar las interacciones directas proteína-proteína entre ATM y p53 en cultivos de células en suspensión expuestos al estrés genotóxico.

Detección y visualización de los complejos de proteínas inducidos por daño de ADN en cultivos de células en suspensión usando el ensayo de ligación de proximidad

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Confocal de la fluorescencia microscopía láser micro-irradiación oferta herramientas y para inducir daño en el ADN y control de la respuesta de proteínas de reparación del ADN en áreas seleccionadas de las nucleares. Esta técnica ha avanzado significativamente nuestro conocimiento de detección de daño, las señales y reclutamiento. Este manuscrito muestra estas tecnologías para examinar reparación de rotura de filamento solo y doble.

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Reparación de roturas del DNA de doble cadena es un proceso dinámico, que requiere no sólo la formación de complejos de reparación en los descansos, pero también su resolución después de la lesión se trata. Aquí, utilizamos microscopia de la inmunofluorescencia para roturas de doble hebra transitorias y duradera como una herramienta para diseccionar este mecanismo de mantenimiento del genoma.

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Aprende a detectar ampollas nucleares y fugas de ADN en células HeLa mediante inmunofluorescencia. Este método permite estudiar laminopatías como el síndrome de progeria y su impacto en la reparación del ADN.

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