Obtención de imágenes de señales de Ca²⁺ en pequeñas venas pulmonares a presiones intraluminales fisiológicas

En este protocolo, presentamos una técnica novedosa para registrar y analizar las señales de Ca²⁺ en las venas intrapulmonares (pequeñas venas pulmonares o PVs) a presiones intraluminales fisiológicas. La técnica consiste en aislar pequeños PV, incubarlos con un indicador de Ca²⁺ , canularlos y presurizarlos, imágenes confocales de señales de Ca²⁺ y análisis de datos.

Las señales de calcio regulan la función de los vasos sanguíneos, variando en su fuente y función. Nuestro objetivo es comprender sus funciones específicas en la pared vascular e identificar las anomalías relacionadas con la enfermedad. La mayoría de los estudios de los vasos sanguíneos pulmonares se centran en las arterias o los capilares, no en las venas pulmonares.

Ningún estudio ha examinado las señales de calcio en las venas pulmonares bajo presiones intraluminales normales a pesar de su relevancia fisiológica. Las venas pulmonares experimentan cambios de presión durante los ciclos cardiovasculares, pero no se estudió su impacto en las señales de calcio. Nuestro protocolo permite la adquisición y el análisis automático de señales de calcio en pequeñas venas pulmonares a presión normal.

Nuestro protocolo permite realizar futuros estudios sobre cómo la presión intraluminal afecta a las señales de calcio en las pequeñas venas pulmonares, avanzando en la comprensión de su regulación y papel en la salud y la enfermedad. Para comenzar, limpie las herramientas de disección y los platos con etanol al 100%, luego lávelos con agua desionizada. Con unas tijeras.

Abrir la cavidad torácica de un ratón sacrificado. Use fórceps para extraer cuidadosamente el corazón y los pulmones de la cavidad torácica con un contacto mínimo de los pulmones. A continuación, coloque el pañuelo en una placa recubierta de protección de sellado que contenga una solución salina fisiológica tamponada HEPES fría.

Sujete el corazón y los pulmones con alfileres de disección para que las venas pulmonares grandes y las arterias pulmonares sean claramente visibles, y el lóbulo izquierdo del pulmón se estire ligeramente. Usando las venas pulmonares grandes como puntos de referencia, retire con cuidado el tejido que rodea las venas interpulmonares pequeñas con la ayuda de unas tijeras finas. A continuación, aísle suavemente las pequeñas venas pulmonares del tejido circundante.

A continuación, prepare una concentración de stock de 2,5 milimolares Fluo-4 AM con DMSO. Con la solución madre, prepare la solución de carga. Coloque las pequeñas venas pulmonares en un tubo de 1,5 mililitros con la solución de carga.

Cubra el tubo con papel de aluminio, incubado en un baño de agua a 37 grados centígrados durante una hora. Para canular las pequeñas venas pulmonares, extraiga una vena de la solución de lavado. Colóquelo en una cámara de miografía a presión preparada.

Con un par de pinzas de punta fina, canula cuidadosamente un extremo de la pequeña vena pulmonar en una de las cánulas, luego use un microfilamento de hilo de nailon para hacer un nudo alrededor del extremo canulado de la pequeña vena pulmonar y la punta de la cánula para asegurarla. Empuje suavemente la solución salina fisiológica a través de la cánula para eliminar la sangre dentro de la vena pulmonar. Use hilo de nailon para atar el otro extremo con una cánula de vidrio usando microfilamentos.

Para obtener imágenes de calcio, primero conecte un servocontrolador de presión a un tubo que contenga una solución salina fisiológica tamponada HEPES. Utilice el controlador para presurizar la pequeña vena pulmonar desde un extremo. Ahora conecte una bomba peristáltica a una entrada y una salida y una salida y superfusione la solución.

Después del período de equilibrio, utilice el objetivo de inmersión en agua de 40x y un sistema de imágenes confocales de disco giratorio para adquirir imágenes de calcio durante 1.000 fotogramas. Para realizar el análisis de imágenes, inicie el Spark y el software de diseño personalizado. Utilice el filtro de cinco por cinco y el filtro de mediana para suavizar las imágenes, seguido de un marco que describa una región plana de la vena pulmonar con varias celdas para la detección automática de eventos.

Haga clic en ver y Detección automática de eventos. Establezca el umbral de eventos en una amplitud de 1,3 F sobre F0, la tolerancia en 20%, el cuadro de escaneo en siete por siete píxeles y el promedio móvil en siete imágenes. Haga clic en Iniciar búsqueda o en el icono del ojo.

Encuentre la tabla de eventos haciendo clic en la tabla de eventos pequeños en el menú de vista, luego calcule los eventos por micrómetro cuadrado dividiendo el número de señales de iones de calcio detectadas por el área del marco seleccionado. El número de señales de calcio que ocurrieron espontáneamente en pequeñas venas pulmonares a cinco milímetros de presión intraluminal de mercurio fue de 0,73 más o menos 0,2 eventos por minuto por micrómetro cuadrado en condiciones basales. La adición de rianodina redujo drásticamente la actividad de señalización del calcio.