Name: Obtención de imágenes de señales de Ca2+ en pequeñas venas pulmonares a presiones intraluminales fisiológicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T13:20:00.000+00:00
Duration: 5 min 35 s
Description: Aprende a obtener imágenes de señales de Ca²⁺ en pequeñas venas pulmonares a presiones intraluminales fisiológicas usando microscopía confocal. Este protocolo permite analizar la regulación vascular en condiciones normales.

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<ol><li>Suresh, K., Shimoda, L. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Lung+circulation%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">Lung circulation.</a> Compr Physiol. 6 (2), 897-943 (2016).</li>
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<li>Kuhr, F. K., Smith, K. A., Song, M. Y., Levitan, I., Yuan, J. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+mechanisms+of+pulmonary+arterial+hypertension%3A+role+of+Ca2%2B+signaling%5BTitle%5D)+AND+%22Am+J+Physiol+Heart+Circ+Physiol%22%5BJournal%5D)">New mechanisms of pulmonary arterial hypertension: role of Ca2+ signaling.</a> Am J Physiol Heart Circ Physiol. 302 (8), H1546-H1562 (2012).</li>
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<li>Haissaguerre, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Spontaneous+initiation+of+atrial+fibrillation+by+ectopic+beats+originating+in+the+pulmonary+veins%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Spontaneous initiation of atrial fibrillation by ectopic beats originating in the pulmonary veins.</a> N Engl J Med. 339 (10), 659-666 (1998).</li>
<li>Heijman, J., Voigt, N., Nattel, S., Dobrev, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cellular+and+molecular+electrophysiology+of+atrial+fibrillation+initiation%2C+maintenance%2C+and+progression%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Cellular and molecular electrophysiology of atrial fibrillation initiation, maintenance, and progression.</a> Circ Res. 114 (9), 1483-1499 (2014).</li>
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<li>Namekata, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+the+Na%28%2B%29%2FCa%282%2B%29+exchanger+in+the+automaticity+of+guinea-pig+pulmonary+vein+myocardium+as+revealed+by+SEA0400%5BTitle%5D)+AND+%22J+Pharmacol+Sci%22%5BJournal%5D)">Involvement of the Na(+)/Ca(2+) exchanger in the automaticity of guinea-pig pulmonary vein myocardium as revealed by SEA0400.</a> J Pharmacol Sci. 110 (1), 111-116 (2009).</li>
<li>Cros, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regional+differences+in+Ca2%2B+signaling+and+transverse-tubules+across+left+atrium+from+adult+sheep%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Regional differences in Ca2+ signaling and transverse-tubules across left atrium from adult sheep.</a> Int J Mol Sci. 24 (3), 2347(2023).</li>
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<li>Fukuta, H., Little, W. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cardiac+cycle+and+the+physiologic+basis+of+left+ventricular+contraction%2C+ejection%2C+relaxation%2C+and+filling%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Fail+Clin%22%5BJournal%5D)">The cardiac cycle and the physiologic basis of left ventricular contraction, ejection, relaxation, and filling.</a> Heart Fail Clin. 4 (1), 1-11 (2008).</li>
<li>Daneva, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Endothelial+IK+and+SK+channel+activation+decreases+pulmonary+arterial+pressure+and+vascular+remodeling+in+pulmonary+hypertension%5BTitle%5D)+AND+%22Pulm+Circ%22%5BJournal%5D)">Endothelial IK and SK channel activation decreases pulmonary arterial pressure and vascular remodeling in pulmonary hypertension.</a> Pulm Circ. 13 (1), e12186(2023).</li>
<li>Marziano, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nitric+oxide-dependent+feedback+loop+regulates+transient+receptor+potential+vanilloid+4+%28TRPV4%29+channel+cooperativity+and+endothelial+function+in+small+pulmonary+arteries%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Heart+Assoc%22%5BJournal%5D)">Nitric oxide-dependent feedback loop regulates transient receptor potential vanilloid 4 (TRPV4) channel cooperativity and endothelial function in small pulmonary arteries.</a> J Am Heart Assoc. 6 (12), e007157(2017).</li>
<li>Chen, Y. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+smooth+muscle+Ca2%2B-signaling+nanodomains+in+blood+pressure+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Novel smooth muscle Ca2+-signaling nanodomains in blood pressure regulation.</a> Circulation. 146 (7), 548-564 (2022).</li>
<li>Sonkusare, S. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Elementary+Ca2%2B+signals+through+endothelial+TRPV4+channels+regulate+vascular+function%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Elementary Ca2+ signals through endothelial TRPV4 channels regulate vascular function.</a> Science. 336, 597-601 (2012).</li>
<li>Arias-Cavieres, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptor-mediated+calcium+release+has+a+key+role+in+hippocampal+LTD+induction%5BTitle%5D)+AND+%22Front+Cell+Neurosci%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptor-mediated calcium release has a key role in hippocampal LTD induction.</a> Front Cell Neurosci. 12, 403(2018).</li>
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<li>Ottolini, M., Sonkusare, S. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+calcium+signaling+mechanisms+in+arterial+smooth+muscle+and+endothelial+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Compr+Physiol%22%5BJournal%5D)">The calcium signaling mechanisms in arterial smooth muscle and endothelial cells.</a> Compr Physiol. 11 (2), 1831-1869 (2021).</li>
<li>Boyette, L. C., Burns, B. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBoyette%2C+LC+%22Physiology%2C+pulmonary+circulation%22">Physiology, pulmonary circulation</a>. , StatPearls Publishing. Treasure Island, FL, USA. (2024).</li>
<li>Ottolini, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Local+peroxynitrite+impairs+endothelial+transient+receptor+potential+vanilloid+4+channels+and+elevates+blood+pressure+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Circulation%22%5BJournal%5D)">Local peroxynitrite impairs endothelial transient receptor potential vanilloid 4 channels and elevates blood pressure in obesity.</a> Circulation. 141 (16), 1318-1333 (2020).</li>
<li>Shan, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Phosphorylation+of+the+ryanodine+receptor+mediates+the+cardiac+fight+or+flight+response+in+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Phosphorylation of the ryanodine receptor mediates the cardiac fight or flight response in mice.</a> J Clin Invest. 120 (12), 4388-4398 (2010).</li>
<li>Knot, H. J., Standen, N. B., Nelson, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ryanodine+receptors+regulate+arterial+diameter+and+wall+%5BCa2%2B%5D+in+cerebral+arteries+of+rat+via+Ca2%2B-dependent+K%2B+channels%5BTitle%5D)+AND+%22J+Physiol%22%5BJournal%5D)">Ryanodine receptors regulate arterial diameter and wall [Ca2+] in cerebral arteries of rat via Ca2+-dependent K+ channels.</a> J Physiol. 1 (Pt 1), 211-221 (1998).</li>
<li>Tischbirek, C., Birkner, A., Jia, H., Sakmann, B., Konnerth, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+two-photon+brain+imaging+with+a+red-shifted+fluorometric+Ca2%2B+indicator%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Deep two-photon brain imaging with a red-shifted fluorometric Ca2+ indicator.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 112 (36), 11377-11382 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Software SparkAn diseñado a medida&nbsp;</td><td>Universidad de Vermont</td><td></td><td></td></tr><tr><td>https://github.com/vesselman/SparkAn Fluo-4, AM</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>F14201</td><td></td></tr><tr><td>FN1 Microscopio vertical&nbsp;</td>Calentador <td>Nikon</td><td></td><td></td></tr><tr><td>/Controlador de temperatura&nbsp;</td>Sistema de imágenes <td>de Warner Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Software de adquisición iQ 3.x</td><td>Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Cámaras iXon EMCCD</td><td>Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Hilo de nylon para atar vasos sanguíneos Sistemas</td><td>vivos Instrumentación</td><td>THR-G</td><td></td></tr><tr><td>Cámara de micografía a presión&nbsp;</td><td>Instalación de instrumentación y modelo, Universidad de Vermont, Burlington, VT, EE. UU.</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Revolution WD (con Borealis) Sistema de imágenes confocales de disco giratorio de alta velocidad</td><td>Andor&nbsp;</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Ryanodine</td><td>Bio-Techne</td><td>1329</td><td></td></tr><tr><td>Servo Controlador de Presión&nbsp;</td><td>Instrumentación de Living Systems Pasadores</td><td></td><td></td></tr> de <tr><td>disección SS, 0,2 mm de diámetro</td><td>Instrumentación de Living Systems</td><td>PIN-0,2 mm</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de tubo REGLO</td><td>ISMATEC</td><td>ISM4212</td><td></td></tr></tbody></table>

obtención de imágenes de señales de ca2+ en pequeñas venas pulmonares a presiones intraluminales fisiológicas

Imaging Ca2+ Signals in Small Pulmonary Veins at Physiological Intraluminal Pressures

La figura 2A muestra un campo de visión de un pequeño PV a una presión intraluminal de 5 mm Hg. Los símbolos + indican las señales Ca2+ detectadas automáticamente dentro de un fotograma seleccionado (Vídeo 1), indicadas por el contorno verde. Se registró un campo de visión de cada PV y se utilizó un PV de cada ratón. Un VP pequeño se consideró como n=1. Se comparó el número de señales de Ca2+ por μm2 por minuto antes y 5 min después de la adición de rianodina inhibidor de RyR (5 μM)23 en experimentos pareados. Se utilizó una prueba t pareada para las comparaciones estadísticas con el fin de detectar diferencias significativas. El número de señales de Ca2+ que ocurrieron espontáneamente fue de 0,73 ± 0,2 eventos por minuto por μm2 (Figura 2B,C) en las condiciones descritas anteriormente. El tratamiento con rianodina inhibió casi por completo las señales de Ca2+ en PV pequeñas (Figura 2C, Video 2), como lo indica una reducción drástica de los eventos por minuto por μm2. Estos datos muestran que la actividad espontánea de las señales de Ca2+ en la capa de miocitos de pequeños PV presurizados representa aperturas de RyR. Estos resultados proporcionan evidencia de que la actividad de las señales de Ca2+ puede estudiarse en pequeñas PVs bajo presiones intraluminales fisiológicas. Este método facilitará futuros estudios sobre los efectos de la presión intraluminal y los mediadores neurohumorales en la señalización de Ca2+ en miocitos PV pequeños, lo que podría ofrecer información valiosa sobre la regulación de la función PV. Si bien el estudio actual se centra en el número de señales RyR Ca2+, también es posible analizar las propiedades cinéticas de estas señales, incluida la duración, la amplitud, la dispersión espacial y el tiempo de elevación. Comprender cómo los estímulos fisiológicos y patológicos afectan las propiedades cinéticas de las señales de RyR Ca2+ puede proporcionar información importante sobre la regulación de la función de PV tanto en estados sanos como enfermos.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67722/67722fig01v2.jpg"> 
Figura 1: Preparación e imagen de Ca2+ de PVs. Imágenes secuenciales que muestran la identificación y el aislamiento de pequeños PV, la incubación de fluo4-AM, la canulación y presurización (5 mm Hg), la obtención de imágenes confocales de alta velocidad en disco giratorio y el análisis de imágenes. El rectángulo discontinuo de la imagen de la izquierda representa el PV utilizado para el estudio. Abreviaturas: PA = arteria pulmonar; RA = aurícula derecha; PV = vena pulmonar; LA = aurícula izquierda. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/67722fig01largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67722/67277fig02.jpg"> 
Figura 2: Análisis de imágenes de Ca2+ . (A) Imágenes de un campo de visión desde un PV presurizado (5 mm Hg), cargado con fluo-4, pequeño en ausencia (izquierda) o presencia de rianodina (5 μM; Inhibidor de RyR, derecha). El rectángulo verde denota el área que se seleccionó para las señales de detección automática Ca2+ . Los signos + representan eventos autodetectados dentro del fotograma. Los signos rojos indican señales con un área inferior a 3000 μm2, mientras que los signos azules indican señales que ocupan un área de más de 3000 μm2. Cada signo + indica un evento o señal Ca2+ . (B) Trazas F/F0 de eventos detectados desde el área seleccionada indicada en A, que muestran la actividad de las señales de Ca2+ en la capa de miocitos de pequeños PV presurizados en condiciones basales (izquierda) y en presencia de rianodina (derecha). (C) Cuantificación de eventos por minuto por μm2 de señales de Ca2+ en pequeños PVs antes y después de la adición de rianodina (1 PV por ratón; n=6 ratones; **p &lt; 0,01 vs Basal; prueba t pareada). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/67277fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Vídeo 1: Señales de Ca2+ en un pequeño PV presurizado a 5 mm Hg antes del tratamiento con ryanodine. El campo de visión representa el fotograma seleccionado, que se muestra en color verde en la Figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/PV_Baseline_5_mm_Hg.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>
Vídeo 2: Señales de Ca2+ en un pequeño PV presurizado a 5 mm Hg después del tratamiento con rianodina (5 μM). El campo de visión representa el fotograma seleccionado, que se muestra en color verde en la Figura 2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67722/PV_Baseline_5_mm_Hg_ryanodine.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Obtención de imágenes de señales de Ca2+ en pequeñas venas pulmonares a presiones intraluminales fisiológicas

Pulmonary veins (PVs) carry oxygen-rich blood from the lungs back to the left heart, thus serving an important function in the delivery of oxygen-rich ...

imaging-ca2-signals-small-pulmonary-veins-at-physiological

Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Para evaluar la difusión y la vasculatura pulmonar respuestas al ejercicio, se describe la técnica de la capacidad de difusión de oxígeno de varias de inspiración para determinar el volumen de sangre capilar y la capacidad de difusión de la membrana, así como agitado ecocardiografía de contraste salino para evaluar el reclutamiento de anastomosis arteriovenosas intrapulmonares.

Evaluación del volumen de sangre capilar pulmonar, la membrana Capacidad de Difusión y intrapulmonar arteriovenosa anastomosis durante el ejercicio

Se describe un protocolo de imagen que permite al médico visualizar, en tiempo real, del paciente intravascular y extravascular espacio volúmenes y definir los parámetros de eliminación diuresis y líquido por consiguiente para el tratamiento seguro y eficiente de edema pulmonar.

Cabecera ultrasonido para el retiro líquido guía en pacientes con Edema pulmonar: el protocolo de caídas de reversa

Las dimensiones de las venas pulmonares (PV) son parámetros importantes a la hora de planificar el aislamiento de las venas pulmonares. La ecocardiografía transesofágica 2D solo puede proporcionar datos limitados sobre los PV; sin embargo, la ecocardiografía 3D puede evaluar diámetros y áreas relevantes de los PV, así como su relación espacial con las estructuras circundantes.

Método ecocardiográfico tridimensional para la visualización y evaluación de parámetros específicos de las venas pulmonares

Aquí, describimos un flujo de trabajo correlativo para la escisión, presurización, fijación e imágenes de la válvula pulmonar murina para determinar la conformación macróstica y las estructuras locales de la matriz extracelular.

Cirugía y procesamiento de muestras para imágenes correlativas de la válvula pulmonar murina

La microscopía de fluorescencia intravital se puede utilizar para estudiar las interacciones leucocitario-endotelial y la perfusión capilar en tiempo real. Este protocolo describe métodos para obtener imágenes y cuantificar estos parámetros en la microcirculación pulmonar utilizando un sistema de imágenes pulmonares estabilizadas por vacío.

Microscopía intravital de fluorescencia de campo ancho de la microcirculación pulmonar en la lesión pulmonar aguda experimental utilizando un sistema de imágenes estabilizado por vacío

La ecografía en el punto de atención (POCUS) de los pulmones proporciona respuestas rápidas en escenarios clínicos que cambian rápidamente. Presentamos un protocolo eficiente e informativo para la adquisición de imágenes para su uso en entornos de cuidados intensivos.

Ecografía pulmonar en el punto de atención en adultos: adquisición de imágenes

La evaluación ecográfica en el punto de atención de la vena cava inferior (VCI) se utiliza comúnmente para identificar, entre otras cosas, el estado del volumen. Las imágenes deben realizarse sistemáticamente para garantizar la repetibilidad. Este manuscrito revisa los métodos y las trampas del examen ecográfico de IVC.

Método de adquisición de imágenes para la evaluación ecográfica de la vena cava inferior

La ecocardiografía intracardíaca (ICE) precisa muestra una precisión significativa en la estimación de la estructura de la aurícula izquierda, un método de estimación de la estructura cardíaca prospectivo y prometedor. En este trabajo se propone un protocolo para el modelado tridimensional de la aurícula izquierda y las venas pulmonares con ICE y remodelación del catéter de mapeo anatómico rápido (FAM).

Modelado tridimensional de la aurícula izquierda y las venas pulmonares con un enfoque preciso de ecocardiografía intracardíaca

Este protocolo demuestra el aislamiento guiado por microscopía y la tinción por inmunofluorescencia de las venas pulmonares murinas. Preparamos muestras de tejido que contienen la aurícula izquierda, las venas pulmonares y los pulmones correspondientes y las teñimos para troponina T cardíaca y conexina 43.

Microdisección y tinción con inmunofluorescencia de mangas miocárdicas en venas pulmonares murinas

El protocolo proporciona un enfoque rápido basado en el fenotipo para la evaluación ecográfica focalizada del paciente hipotenso, utilizando imágenes subcostales de la vena cava inferior y el corazón, con vistas adicionales de los pulmones superiores y los espacios pleurales.

Evaluación ecocardiográfica mediante examen subxifoideo solo para pacientes hipotensos

Aquí presentamos un protocolo para la aplicación de POCUS junto a la cama en la gestión del ARDS dentro de la UCI. Detalla técnicas estandarizadas para evaluaciones pulmonares, cardíacas, diafragmáticas, venosas y gástricas para guiar la ventilación, predecir el destete y prevenir complicaciones.

La aplicación de la ecografía en el punto de atención (POCUS) en el manejo del Síndrome de Dificultad Respiratoria Aguda (SDRA) en la Unidad de Cuidados Intensivos

Aprende a obtener imágenes de señales de Ca²⁺ en pequeñas venas pulmonares a presiones intraluminales fisiológicas usando microscopía confocal. Este protocolo permite analizar la regulación vascular en condiciones normales.

Obtención de imágenes de señales de Ca²⁺ en pequeñas venas pulmonares a presiones intraluminales fisiológicas

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