In vitro Prueba de trombosis para dispositivos de asistencia ventricular

Nuestro objetivo es desarrollar un protocolo de sobremesa práctico y accesible para identificar posibles puntos calientes trombogénicos en los dispositivos de asistencia ventricular, cerrando la brecha crítica entre la creación temprana de prototipos y las pruebas en animales. La experimentación con animales ha persistido como el método principal para evaluar la trombosis en los dispositivos de asistencia ventricular. Si bien la dinámica de fluidos computacional se ha convertido en una herramienta invaluable para la verificación del diseño, aún no puede suplantar la validación in vitro e in vivo.

La naturaleza compleja de la coagulación sanguínea está presente y numerosos factores de confusión, lo que dificulta la distinción entre la trombogenicidad real del dispositivo y los artefactos experimentales. Los métodos in vitro para evaluar la trombosis en los DAV siguen estando infrautilizados, y hasta la fecha no existe ningún método estandarizado. Al ofrecer un protocolo completo y una guía de video, esperamos facilitar una adopción más amplia de los métodos de sobremesa.

Este método aborda un desafío técnico y ético en el desarrollo de dispositivos médicos, reduciendo la dependencia de las pruebas en animales, al tiempo que mejora la capacidad de detectar riesgos de trombosis en las primeras etapas del proceso de desarrollo. Para comenzar, llene el circuito de prueba con 150 mililitros de sangre. Elimine todo el aire atrapado en el bucle.

Si utiliza una bomba de sangre de flujo axial, gírela a una posición vertical para liberar aire a través de la flotabilidad. Si usa una bomba centrífuga, gírela boca abajo y gírela para asegurarse de que no quede aire atrapado en las rutas de flujo secundarias. Golpee suavemente las superficies de los tubos y del depósito y exprima las burbujas de aire para desalojarlas.

Inspeccione de cerca las secciones horizontales de la tubería y las uniones entre la tubería y los conectores para asegurarse de que no haya burbujas de aire. Apriete la bolsa intravenosa para acercar el nivel del líquido a la parte superior estrecha. A continuación, sujete la bolsa con un hemostático a través de la línea de fluido para eliminar la interfaz fluido-aire y cierre la llave de paso de ventilación de aire.

A continuación, cierre la llave de paso al final de las líneas de presión. Retire el tubo del manómetro y coloque una jeringa de tres mililitros. Abra la llave de paso y extraiga de uno a dos mililitros de líquido en la línea de extensión, aproximadamente cuatro centímetros.

Cierre la llave de paso, separe la jeringa y vuelva a conectar el tubo del manómetro. Abra la llave de paso para habilitar las lecturas de presión. Finalmente, cebe el puerto de muestreo con una jeringa.

A continuación, corte o rasgue una toallita sin pelusa en tres fragmentos iguales. Gire la esquina de un fragmento para formar una punta e insértelo en el puerto de inyección para absorber la sangre residual. Retuerce el segundo fragmento.

Humedece con solución salina e inserta la punta húmeda en el puerto para eliminar toda la sangre restante. Utilice el tercer fragmento para absorber cualquier solución salina residual en el puerto. Ahora encienda el dispositivo de asistencia ventricular, o VAD, a baja velocidad y hágalo funcionar durante unos cinco segundos para desalojar cualquier burbuja de aire atrapada dentro de la bomba.

Detenga la bomba. Si aparecen burbujas en la bolsa, repita la desaireación. Reinicie la bomba a baja velocidad para que la sangre circule por el circuito.

Transfiera un mililitro de heparina sódica, dos mililitros de la solución de cloruro de calcio preparada y 1.5 mililitros de EDTA en tubos separados. Para añadir heparina a la sangre en el asa, aspire 75 unidades de heparina en una micropipeta y dispense en una jeringa de tres mililitros dispensando simultáneamente la pipeta y extrayendo el émbolo de la jeringa sin derramar. Utilice el puerto transversal de la llave de paso de tres vías para administrar sustancias en el bucle con una jeringa.

Gire el bloqueo del señuelo macho en la llave de paso para que el puerto de inyección mire hacia arriba para atrapar las burbujas de aire en la parte superior. Ahora conecte la jeringa al puerto de inyección a través del bloqueo de señuelo con el puerto hacia arriba y la jeringa apuntando verticalmente hacia abajo. Extraiga el émbolo de la jeringa para llenarlo con sangre y mezcle la heparina con la sangre mientras aspira el aire en la jeringa.

Permita que las burbujas de aire suban hasta la parte superior de la jeringa. A continuación, inyecte la mezcla en el circuito, asegurándose de que no entre aire. Transfiera la sangre dentro y fuera de la jeringa cuatro o cinco veces para asegurarse de que la sangre heparinizada no quede confinada en el espacio del puerto.

Para valorar el tiempo de coagulación activado, o ACT, de la sangre en el asa, primero agregue 750 microlitros de solución de cloruro de calcio de un molar a 150 mililitros de sangre en el asa. Para evitar la coagulación de la sangre, inyecte rápidamente el líquido después de eliminar el aire residual. Alternativamente, diluya el cloruro de calcio en la jeringa con un mililitro de solución salina tamponada con tris para reducir la coagulación prematura.

Después de dejar circular el cloruro de calcio inyectado durante al menos dos minutos, conecte una jeringa de un mililitro al puerto de muestreo. Extraiga y deseche 0,5 mililitros de sangre residual para eliminar la sangre estancada del puerto. A continuación, conecte una nueva jeringa de un mililitro al puerto de muestreo y extraiga 0,5 mililitros de sangre para su análisis.

Mida el tiempo de coagulación activado utilizando un sistema de coagulación de sangre completa en el punto de atención. Limpie el puerto de muestreo con toallitas sin pelusa como se demostró anteriormente. Consulte los valores de valoración para informar la concentración objetivo de cloruro de calcio.

Aumente gradualmente la concentración de calcio para lograr un tiempo de coagulación activado de 300 segundos. Comenzar la prueba de trombosis in vitro una vez que se haya alcanzado el ACT de 300 segundos en el bucle. Ajuste la bomba al caudal y la presión deseados modificando la velocidad del rotor y regulando la resistencia con la abrazadera Hoffman.

Mida el ACT cada 15 minutos extrayendo una muestra de sangre del asa y colocando una gota de sangre en el instrumento ACT, como se demostró anteriormente. Si el ACT cae por debajo de 200 segundos, inyecte 25 unidades adicionales de heparina sódica en el asa. Después de una hora, inyecte 1,5 mililitros de EDTA 0,5 molar en el asa para inhibir la coagulación adicional.

Deje que el EDTA circule y mezcle durante dos minutos, luego detenga la bomba. Usando hemostáticos, sujete el tubo conectado a la entrada y salida de la bomba, colocando las abrazaderas a tres o cuatro centímetros de distancia de las lengüetas de entrada y salida. Desconecte con cuidado el tubo para liberar la bomba.

A continuación, drene la sangre de la bomba y del circuito de flujo en un recipiente. Por último, pipetee solución salina a través de la entrada y salida de la bomba para lavar la sangre residual. La deposición de plaquetas se observó consistentemente a lo largo de las raíces de las cuchillas en los prototipos de bombas.

El electropulido de los componentes de titanio eliminó la formación de trombos en estas zonas. El prototipo también tenía una cooptación imperfecta en la unión de los componentes de la carcasa de proa y popa, lo que resultaba en una grieta donde la sangre se filtraba y coagulaba. El lapeado y el pulido mejoraron el ajuste de los componentes y redujeron la formación de trombos.

Los errores de procedimiento y la desemisión incompleta del bucle pueden introducir artefactos. En este caso, un error experimental durante la inyección de cloruro de calcio desencadenó una coagulación localizada, y el trombo resultante entró en la bomba centrífuga de levitación magnética, ocluyendo la trayectoria del flujo. Los coágulos esféricos y poco adheridos que se observan en las superficies suelen ser el resultado de burbujas de aire encapsuladas dentro de coágulos.

El material extraño y los residuos que circulaban en el bucle también se encapsularon en los trombos y se adhirieron a las superficies de las bombas. Los trombos anulares en las uniones de los conectores de los tubos fueron indicativos de un rango óptimo de ACT durante la prueba.