Edición del genoma del mosquito Aedes aegypti de la fiebre amarilla mediante CRISPR-Cas9

En este trabajo describimos un protocolo detallado para la edición del genoma mediante microinyección embrionaria en el mosquito A. aegypti utilizando la tecnología CRISPR-Cas9.

El alcance de nuestra investigación implica el establecimiento de líneas de mosquitos genéticamente modificadas utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. El uso de la tecnología CRISPR-Cas9 para la supresión de la población de mosquitos, PgSIT, así como para el establecimiento de los sistemas de expresión binaria para el control espacio-temporal de la expresión génica.

Hemos obtenido líneas de knockout y knockin utilizando la tecnología CRISPR-Cas9. Nuestras líneas knockin incluyen la inserción del transactivador QF que permite el control temporal espacial de genes aguas abajo, como marcadores fluorescentes, GFP, para el etiquetado específico de tejidos y reporteros de actividad neuronal, G-CaMP6.

El establecimiento de nuevas líneas mutantes de mosquitos permitirá una comprensión más profunda de la función genética y las implicaciones nerviosas, fisiológicas y conductuales. Esto puede conducir al desarrollo de nuevas formas de prevenir la transmisión de enfermedades transmitidas por mosquitos. Nuestro laboratorio ha desarrollado la tecnología para la supresión de la población de mosquitos que se basa en la tecnología CRISPR-Cas9 para eliminar genes relacionados con la fertilidad masculina y la viabilidad femenina. Además, hemos establecido múltiples líneas de mosquitos para el estudio de la resistencia sensorial de los mosquitos, específicamente el olfato y la visión.

[Entrevistador] Para preparar la construcción de inyección para mutantes knockout, diluya la proteína Cas9 a la concentración deseada utilizando el tampón de dilución Cas9. Luego diluya la alícuota de ARN guía sintetizado in vitro o ARNg con agua ultrapura. Premezcle la proteína Cas9 diluida con cada ARNg para formar un complejo de ribonucleoproteína. Luego combine las múltiples soluciones complejas de ribonucleoproteínas premezcladas. Para inserciones de casetes de genes mediados por reparación dirigida por homología, diluya y mezcle la proteína Cas9 y los ARNg. Diluir el plásmido donante con agua ultrapura y combinar todas las construcciones. A continuación, use un filamento de cuarzo para preparar las agujas de microinyección. Usando el siguiente programa. Tire de las agujas con un extractor de micropipetas láser. Después de configurar un aspirador manual, humedezca los papeles de filtro circulares blancos y colóquelos en la pared interior o encima del algodón húmedo dentro del colector. Coloque de cinco a 10 mosquitos hembra que fueron alimentados con sangre hace cinco a 10 días en el colector. Luego coloque el colector en la oscuridad durante 45 minutos. Luego, retire los mosquitos del colector. Después de la incubación, retire los papeles de filtro para cosechar los embriones. Seleccione embriones en etapa pre-blastodermo que sean de color gris claro del papel de recolección. Transfiera los embriones seleccionados con un cepillo húmedo a cinta adhesiva de doble cara colocada encima de un cubreobjetos. Alinee los embriones en paralelo, asegurándose de que estén uno al lado del otro con todos los extremos posteriores hacia el frente mientras sus alrededores permanecen húmedos. Durante la alineación, agregue aceite de halocarbono 700 a los embriones para evitar la desecación. En el microinyector, configure una presión de compensación de 300 hectopascales y una presión de inyección de 500 hectopascales. Con un microcargador, cargue tres microlitros de la construcción de inyección en una aguja. Coloque el cubreobjetos con embriones alineados en un portaobjetos de microscopio y colóquelo bajo el microscopio para inyectarlo. A continuación, asegure una aguja en el portaagujas con un micromanipulador en un ángulo de 10 grados hacia el extremo posterior de los embriones. Abra la aguja suavemente tocando ligeramente su punta con el borde del cubreobjetos. Luego inyecte el embrión con la construcción plásmida. Después de inyectar a los mosquitos Aedes agyptie con la construcción de inyección, use toallitas desechables sin pelusa para eliminar el aceite que rodea los embriones. Agregue agua desionizada para enjuagar los embriones. Transfiera los embriones enjuagados a un papel de filtro húmedo y coloque el papel de filtro en un pañuelo húmedo dentro de una taza de nueve onzas de Karat. Luego coloque algodón húmedo en el fondo de la taza para mantener la humedad. Después de mantener los embriones húmedos durante tres o cuatro días, transfiera el papel de filtro con los embriones a aproximadamente tres litros de agua desionizada en una bandeja Sterilite de seis cuartos para eclosionar. Una vez que las larvas G cero eclosionen, agregue comida para peces mezclada con agua a la sartén. Examine las larvas G cero para detectar el marcador fluorescente en la etapa larvaria del tercer al cuarto estadio. Separe las larvas según su estado fluorescente. Mantenga las larvas fluorescentes positivas y fluorescentes negativas en bandejas separadas. Separe los mosquitos inyectados por sexo cuando pupan e identifique a los machos por su tamaño más pequeño, lóbulo genital más prominente y puntiagudo y paletas más anchas. Identifique a las hembras por su tamaño más grande, lóbulo genital menos pronunciado y paletas más estrechas. Después de agrupar mosquitos fluorescentes positivos o fluorescentes negativos de cada sexo, cruce cada grupo con mosquitos del sexo opuesto de la cepa Liverpool A. agyptie de tipo salvaje en una proporción de tres a cinco individuos de tipo salvaje por cada individuo filtrado fluorescente, lo que les permite aparearse durante cuatro días. Después de tres o cuatro días, examine las larvas G1 para detectar el marcador fluorescente en las etapas larvales del tercer al cuarto estadio.