Purificación del retículo sarcoendoplásmico Ca²⁺-ATPasa a partir de músculo de conejo

Nuestra investigación se centra en purificar SERCA, con alta calidad estructural y actividad catalítica, al tiempo que investigamos si la trehalosa estabiliza SERCA durante la purificación, mejorando su estabilidad y funcionalidad. La determinación de la estructura tridimensional de las ATPasas de tipo P en sus estados oligoméricos. El uso de inteligencia artificial para el modelado estructural de ATPasas, las simulaciones de dinámica estructural y el acoplamiento molecular de ligandos para explorar la terapéutica de la enfermedad y mejorar el análisis de la función de las proteínas y las tecnologías más nuevas. Los desafíos actuales incluyen comprender los mecanismos de conversión de energía en las P-ATPasas, dilucidar cómo la estructura cuaternaria regula la función y la actividad, e identificar inhibidores efectivos para la aplicación terapéutica en enfermedades humanas. Confirmamos el estado hexámero de la protón-ATPasa de la membrana plasmática GS y demostramos su dependencia de la dinámica estructural o viscosidad del medio como lo describe la teoría de Kramers.

[Narrador] Para comenzar, obtenga músculo de contracción rápida del Oryctolagus cuniculus de tipo salvaje. Suspenderlo en tres volúmenes de cloruro de potasio 100 milimolar para la maceración. Licúa durante un minuto, seguido de un minuto de reposo helado. Centrifugar la muestra a 1.500 g a 4 grados centígrados durante 5 minutos para eliminar los restos de tejido. Recoja el sobrenadante en un tubo, luego homogeneícelo con un molinillo de tejidos. A continuación, centrifugar el homogeneizado, seguido del sobrenadante. Suspender los gránulos en aproximadamente 40 mililitros de sacarosa molar 0,5. Ahora, centrifuga la suspensión a 12.000 g a 4 grados centígrados durante 15 minutos. Diluir el sobrenadante resultante en cloruro de potasio 0,6 molar y sacarosa 0,15 molar antes de centrifugar. Suspenda el sedimento que contiene láminas de vesícula de retículo sarcoplásmico en un tampón que contenga 0,3 molares de sacarosa, 0,1 molares de cloruro de potasio y 5 milimolares de Tris-clorhidrato a pH 7,0. Alícuota de las vesículas del retículo sarcoplásmico en volúmenes de 1 mililitro. Incube la suspensión de vesícula del retículo sarcoplásmico en hielo durante 10 minutos con agitación suave, luego centrifuge. Suspenda el gránulo en menos de 3 mililitros de tampón de clorhidrato de Tris de 25 milimolares. Después de homogeneizar la suspensión, ajústela a un volumen final de 10 mililitros con tampón de clorhidrato de Tris. Determine la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Lowry. Agregue azolectina a 5 miligramos por mililitros y luego agregue 0.85 Zwittergent 3-14. Homogeneizar la suspensión nuevamente y centrifugar a 100.000 g a 4 grados centígrados durante 60 minutos. Recoge el sobrenadante en un tubo nuevo. Diluirlo en una proporción de 1 a 2 con EGTA 2 milimolares a pH 7,2. Vierta la suspensión suavemente sobre un gradiente de concentración de trehalosa discontinuo en el tampón Tris. Luego centrifugar como antes y recoger el gránulo transparente y ligeramente amarillo. Suspenda el gránulo suavemente en un pequeño volumen de tampón Tris. Mida la concentración de proteína, luego dilúyala para ajustar la concentración de proteína a 2 miligramos por mililitro. Para la actividad de ATPasa, prepare 1 mililitro de la mezcla de reacción. Agite el ensayo de reacción para homogeneizarlo, luego incubarlo a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Agregue 0,9 unidades de L-lactato deshidrogenasa y 1,5 unidades de piruvato quinasa. Agregue 10 microgramos de SERCA para iniciar la reacción de ATPasa. Monitoree el cambio de absorbancia cada segundo durante 600 segundos a 340 nanómetros con un espectrofotómetro que tiene un soporte de celda termostática para determinar la formación de NAD. Para el ensayo de marcado de SERCA con isotiocianato de fluoresceína, o FITC, primero suspenda 20 microgramos de SERCA en 50 microlitros de tampón de etiquetado. Vórtice para mezclar bien. Luego incube las muestras en la oscuridad a temperatura ambiente durante 15, 10, 7, 5 y 2 minutos. Para detener la reacción de etiquetado, agregue un volumen igual de tampón de parada helado. Incube sobre hielo en la oscuridad durante 5 minutos. Sujete el SERCA etiquetado por FITC a SDS-PAGE. Exponga los geles transparentes a la luz ultravioleta a una longitud de onda de 302 nanómetros y fotodocumente el resultado. Finalmente, tiñe el gel con azul Coomassie. Fotodocumente el resultado. Para el análisis de espectros de dicroísmo circular, primero suspenda SERCA en 400 microlitros de tampón de fosfato de 10 milimolares de pH 7.0 a 25 grados Celsius. Cargue la muestra en una celda con una longitud de ruta de 0,1 centímetros. Ahora, establezca el rango de espectros ultravioleta lejano entre 190 y 260 nanómetros y la resolución interna y el ancho de banda en 1 nanómetro. Registre la señal de dicroísmo circular a una velocidad de 50 nanómetros por minuto a 25 grados Celsius. El gel SDS-PAGE teñido con azul de Coomassie demostró el enriquecimiento de la banda de proteína SERCA a medida que avanzaba la purificación. El paso final de purificación de SERCA mediante ultracentrifugación en un gradiente de concentración de trehalosa dio como resultado una pureza superior al 90%. Las vesículas del retículo sarcoplásmico contenían una alta cantidad de SERCA, con aproximadamente el 73% de la proteína total en las vesículas correspondiente a esta P-ATPasa. Se observó un patrón cinético de Michaelis-Menten para el SERCA purificado en la curva de tasa de hidrólisis de ATP frente a la concentración de ATP, lo que confirma su funcionalidad enzimática. El gráfico de Lineweaver-Burk reveló una constante de Michaelis de aproximadamente 10 micromoles para ATP, consistente con los valores informados anteriormente. El etiquetado FITC de SERCA indicó un sitio de unión de nucleótidos intacto. La banda SERCA teñida de azul de Coomassie correspondía exactamente a la banda marcada con FITC. La espectroscopia de dicroísmo circular confirmó la alta calidad estructural del SERCA purificado, con su espectro indicando elementos de estructura secundaria bien definidos.