Name: Purificación del retículo sarcoendoplásmico Ca2+-ATPasa a partir de músculo de conejo (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:00:00.000+00:00
Duration: 8 min 37 s
Description: Aprende a purificar la Ca²⁺-ATPasa del retículo sarcoplásmico (SERCA) de músculo de conejo utilizando trehalosa como estabilizante. Este método bioquímico produce proteína con alta pureza y actividad catalítica para estudios estructurales.

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Todos los procedimientos con animales se realizaron de acuerdo con los lineamientos internacionales y locales (NORMA Oficial Mexicana NOM-062-ZOO-1999) para el manejo de animales en laboratorios experimentales 51,67,68. El tejido muscular se obtuvo de Oryctolagus cuniculus de tipo silvestre de una unidad local de manejo de animales (INE/CITES/DGVS-ZOO-E0055-SLP-98)46. Un veterinario con experiencia en el manejo de animales de laboratorio realizó la disección y el procesamiento muscular inicial. Los detalles de los reactivos y el equipo utilizado en este estudio se enumeran en la Tabla de Materiales.
1. Aislamiento del retículo sarcoplásmico del músculo de conejo de contracción rápida (Temporización, 7 - 9 h)
NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Champeil et al.69.
<ol>
	<li>Obtenga tejido muscular de contracción rápida (~70 g de ambas patas traseras por animal) del Oryctolagus cuniculus de tipo salvaje. NOTA: Se requiere la identificación visual previa de los músculos a diseccionar70,71.</li>
	<li>Macerar el músculo de contracción rápida en una licuadora suspendiéndolo en tres volúmenes de 100 mM de KCl, con 1 min encendido y 1 min en reposo helado, repetir tres veces72.</li>
	<li>Eliminar los restos de tejido por centrifugación (1500 × g) a 4 °C durante 5 min; Si es necesario, se realiza una segunda centrifugación (4200 × g).</li>
	<li>Recoger el sobrenadante y homogeneizarlo con una trituradora de tejidos (10 golpes a baja velocidad, es decir, 500-1.500 rpm)72,73. Centrifugar el homogeneizado (10.000 × g) a 4 °C durante 15 min. NOTA: Se debe tener cuidado al homogeneizar, ya que el uso de una velocidad relativamente alta puede provocar daños en el sistema y en el operador.</li>
	<li>Centrifugar el sobrenadante (que contiene el retículo sarcoplásmico) (33.000 × g) a 4 °C durante 120 min.</li>
	<li>Suspender los pellets en 40 mL de 0,5 M de sacarosa y centrifugar (12.000 × g) a 4 °C durante 15 min. Diluir el sobrenadante (0,6 M de KCl y 0,15 M de sacarosa) y centrifugar la suspensión (34.000 × g) a 4 °C durante 165 min.</li>
	<li>Suspenda el pellet que contiene las hojas de las vesículas del retículo sarcoplásmico (SRV) en 0,3 M de sacarosa, 0,1 M de KCl y 5 mM de Tris-HCl, pH 7,0. Determine la concentración de proteínas utilizando el ensayo de Lowry74 y la albúmina sérica humana como patrón de proteína.</li>
	<li>Alícuota los SRV (30-32 mg/mL) en volumen de 1 mL. Almacene las muestras de SRV a -72 °C para su posterior procesamiento. NOTA: El rendimiento de proteína es de 100-110 mg SRV por animal.</li>
</ol>
2. Purificación SERCA (Temporización, 18 - 20 h)
NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Rivera-Morán et al.46.
<ol>
	<li>Diluya la suspensión de SRV a 2 mg de proteína/mL usando 75 mM de Tris-HCl helado, pH 7.2, 0.6 M de KCl, 6 mM de EDTA, 1 mM de EGTA y 0.1% (p/v) de desoxicolato (DOC). Incubar la suspensión de SRV en hielo durante 10 minutos y agitar suavemente. Centrifugar la suspensión del SRV (100.000 × g) a 4 °C durante 60 min. NOTA: El DOC debe agregarse gota a gota.</li>
	<li>Suspenda los gránulos en &lt;3 mL de 25 mM de Tris-HCl, pH 7.5, 0.3 M de KCl, 45% de glicerol (v/v) y 2 mM de EDTA. Homogeneizar la suspensión y ajustar a un volumen final de 10 mL. Determine la concentración de proteínas y luego ajústela a 6.5 mg/mL. Añadir azolectina a 5 mg/mL y Zwittergent 3-14 (p/p) 0,85 (p/p). NOTA: Azolectin y Zwittergent 3-14 deben agregarse gota a gota.</li>
	<li>Homogeneizar la suspensión y la centrífuga (100.000 × g) a 4 °C durante 60 min. Recoger el sobrenadante y diluir 1:2 con 2 mM de EGTA (pH 7,2).</li>
	<li>Vierta la suspensión suavemente sobre un gradiente de concentración de trehalosa discontinuo (45, 40, 35 y 30% p/v) en 10 mM de Tris-HCl, pH 7,0, 1 mM de EDTA, 0,1% de desoxicolato y 1 mg/mL de azolectina. Centrífuga (100.000 × g) a 4 °C durante 14 h. Recoja la bolita transparente y ligeramente amarillenta que se forma en la parte inferior de los tubos. NOTA: Tanto la formación del gradiente de trehalosa como la adición de la suspensión de la muestra deben realizarse utilizando técnicas adecuadas. Se recomienda la centrifugación durante la noche.</li>
	<li>Suspenda suavemente el pellet en un pequeño volumen (&lt;1,5 mL) de 25 mM de Tris-HCl, pH 7,5, 0,3 de M KCl, 45% de glicerol y 2 mM de EDTA. Determinar la concentración de proteínas. Ajustar la concentración de proteínas por dilución a 2 mg/mL. Tome alícuotas (~50 μL) de la suspensión y almacene el SERCA purificado a -72 °C hasta su uso.</li>
	<li>Realizar SDS-PAGE del SERCA72 purificado, y de muestras de proteínas tomadas en diferentes etapas de purificación. Tiñe el gel con Coomassie Blue72. NOTA: El uso de trehalosa 0,6 M en lugar de glicerol en el tampón de suspensión aumenta la estabilidad de la enzima durante los ciclos de almacenamiento y congelación-descongelación28,29.</li>
</ol>
3. Ensayo de la actividad de la ATPasa (Temporización, 1 - 2 h)
<ol>
	<li>Ensayo acoplado a enzimas: ATPasa-piruvato quinasa-lactato deshidrogenasa<ol>
		<li>Prepare la mezcla de reacción (1 mL): 50 mM MOPS (pH 7,0), 1 mM EGTA, 80 mM KCl, 5 mM MgCl2, 3 mM CaCl2, 5 mM fosfoenolpiruvato, 250 μM NADH. Incluyen concentraciones variables de ATP (0,001 a 0,25 mM).</li>
		<li>Homogeneizar cuidadosamente el ensayo de reacción por vórtice. Incubar el ensayo de reacción a 37 ◦C durante 10 min. Añadir 0,9 U de L-lactato deshidrogenasa (LDH) y 1,5 U de piruvato quinasa (PK).</li>
		<li>Iniciar la reacción de ATPasa mediante la adición de 10 μg de SERCA.</li>
		<li>Determinar la formación de NADH. Siga el cambio en la intensidad de la absorbancia cada segundo durante 600 s a una longitud de onda (λ) de 340 nm a lo largo del tiempo utilizando un espectrofotómetro con un soporte de celda termostático. NOTA: El intervalo de tiempo para la medición de la absorbancia puede variar, pero intente registrar tantos puntos de datos como sea posible para dibujar la línea recta inicial de la reacción de ATPasa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinar la tasa de hidrólisis de ATP NOTA: Para más detalles sobre el procedimiento, consultar Rivera-Morán et al.46.<ol>
		<li>Calcule el valor de la pendiente (Δabs/min) de la porción lineal en cada curva formada. Utilice el coeficiente de extinción molar (ε) de NADH (λ = 6,220 M−1·cm−1) para determinar la actividad de la ATPasa (μmoles de ATP hidrolizado/min.mg prot.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Determinar los parámetros cinéticos K,m y Vmax
	<ol>
		<li>Trace los datos de velocidad frente a la concentración de ATP utilizando software de análisis de datos y gráficos.</li>
		<li>Ajuste los datos por regresión no lineal a la ecuación de Michaelis-Menten (Ec. 1)46: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67748/67748eq01.jpg" style="margin: auto;"> donde v es la velocidad, Vmax es la velocidad máxima, [S] es la concentración de ATP y Km es la constante de Michaelis-Menten.</li>
		<li>Determine K, m y Vmax por iteración. NOTA: La inclusión de DOC puede aumentar la respuesta de la tasa de ATPasa; Se recomienda probar diferentes concentraciones de DOC para encontrar el óptimo.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Ensayo de marcaje de SERCA con isotiocianato de fluoresceína (FITC) (Tiempo, 30 - 45 min, solo para el etiquetado FITC)
NOTA: Para obtener detalles sobre el procedimiento, consulte 54,75,76.
<ol>
	<li>Suspender SERCA (20 μg) en 50 μL (volumen final) de tampón de etiquetado (100 mM de KCl, 5 mM de MgCl2 y 30 mM de Tris-HCl, pH 8,9) que contenga 1 mM de FITC. Mezclar por vórtice.</li>
	<li>Incubar las muestras en diferentes momentos (15 min, 10 min, 7 min, 5 min y 2 min) en la oscuridad y a temperatura ambiente.</li>
	<li>Detenga la reacción de etiquetado añadiendo 1 volumen de tampón de parada helado (480 mM de sacarosa y 48 mM de MOPS, pH 7,0), que contenga ATP (5 mM). Incubar en hielo durante 5 minutos en la oscuridad.</li>
	<li>Sumeta el SERCA etiquetado por FITC a SDS-PÁGINA72. Exponga los geles transparentes a la luz ultravioleta (λ = 302 nm). Fotodocumenta el resultado.</li>
	<li>Tiñe el gel con azul Coomassie. Fotodocumenta el resultado. NOTA: Realizar el marcaje FITC en una habitación oscura puede mejorar la calidad de la señal de fluorescencia.</li>
</ol>
5. Espectros de dicroísmo circular (CD) (Temporización, 30 min)
NOTA: Para obtener más información sobre el procedimiento, consulte11,77.
<ol>
	<li>Suspender SERCA (3 μM) en 400 μL de tampón fosfato de 10 mM (pH 7,0) a 25 °C.</li>
	<li>Cargue la muestra en una celda de 0,1 cm de longitud de trayectoria. Establezca el rango de espectros UV lejanos λ entre 190-260 nm. Establezca la resolución interna y el ancho de banda en 1 nm.</li>
	<li>Grabe la señal de CD a 50 nm/min a 25 °C.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>ATP</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>A2383</td><td></td></tr><tr><td>Azolectina de soja</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>44924</td><td></td></tr><tr><td>Transiluminador UV de sobremesa&nbsp;</td><td>Cole-Parmer</td><td>EW-97623-08</td><td>Ajuste alto de doble intensidad es ideal para la documentación analítica. La configuración baja reduce el fotonicking o fotoblanqueo de muestras de gel mientras se realiza un trabajo preparatorio.</td></tr><tr><td>CaCl2 &bull; 2H2O</td><td>Cámara Sigma-Aldrich Corp</td><td>223506</td><td></td></tr><tr><td>Coolpix B500&nbsp;</td><td>Nikon Corp</td><td>S210</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie azul brillante G-250</td><td>Bio-Rad 1610406</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Dodecil maltósido</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D4641</td><td></td></tr><tr><td>Etilenglicol-bis(2-aminoetiliéter)-N,N,N&prime;,N&prime; Ácido -tetraacético</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E4378</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilendiaminotetraacético sal tetrasódica dihidratada</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>E6511</td><td></td></tr><tr><td>Isotiocianato de fluoresceína</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>F3651</td><td></td></tr><tr><td>KCl JT</td><td>Baker</td><td>7447-40-7</td><td></td></tr><tr><td>MgCl2 &bull; 6H2O</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M9272</td><td></td></tr><tr><td>MOPS</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>M1254</td><td></td></tr><tr><td>NADH</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>230</td><td></td></tr><tr><td>N-tetradecil-N,N- dimetil-3-amonio-1-propanosulfonato</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D0431</td><td></td></tr><tr><td>Fosfoenolpiruvato (PEP)</td><td>Chem-Impex International Inc</td><td>9711</td><td></td></tr><tr><td>Lactato deshidrogenasa muscular de conejo</td><td>Roche</td><td>10003557103</td><td></td></tr><tr><td>Músculo de conejo piruvato quinasa</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>P1506</td><td></td></tr><tr><td>Desoxicolato de sodio</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>D6750</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sodio</td><td>Bio-Rad</td><td>1610302</td><td></td></tr><tr><td>Espectropolarímetro&nbsp;</td><td>Jasco Corp.</td><td>Jasco J1500&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>84100</td><td></td></tr><tr><td>Trehalosa</td><td>Sigma-Aldrich Corp</td><td>T0167</td><td>Dihidrato</td></tr><tr><td>Tris(hidroximetil)aminometano clorhidrato</td><td>Ultracentrífuga Sigma-Aldrich Corp</td><td>857645</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Beckman</td><td>Optima Espectrofotómetro</td><td></td></tr><tr><td>UV/VIS</td><td>Agilent Technologies</td><td>8453</td><td>El espectrofotómetro UV-Vis Agilent 8453 utiliza una matriz de fotodiodos para la medición simultánea de todo el espectro de luz ultravioleta a luz visible</td></tr><tr><td>WiseStir HS- 30E</td><td>Daihan Scientific Co.</td><td>Dh. WOS01010</td><td>Ideal para todas las aplicaciones de desperado y homogeneización, diseñado para trituradoras de tejidos.</td></tr></tbody></table>

purificación del retículo sarcoendoplásmico ca2+-atpasa a partir de músculo de conejo

Purification of the Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+-ATPase from Rabbit Muscle

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Purificación del retículo sarcoendoplásmico Ca2+-ATPasa a partir de músculo de conejo

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