Extracción y limpieza de tejidos: preparación de muestras de cerebro-médula espinal de ratón

Nuestra investigación se centra en cómo el sistema nervioso central media las funciones cognitivas e interactúa con el sistema inmunológico. Nuestro objetivo es mejorar los métodos para examinar el cerebro y la médula espinal, abordando las preguntas fundamentales sobre estas interacciones. Estos métodos mantienen intactos todo el cerebro y la médula espinal, lo que nos ayuda a mapear la célula más a fondo mediante la limpieza de tejidos. También hace que el proceso sea más rápido y preciso, reduciendo el tiempo y los errores en comparación con los métodos tradicionales de corte e imagen.

Hemos mapeado el cerebro y las regiones de la médula espinal conectadas a los pulmones produciendo . Nuestra investigación se centrará en explorar la comunicación neuroinmune entre el cerebro, la médula espinal y los pulmones. Y cómo esta interacción influye en las respuestas inmunitarias.

[Instructor] Para comenzar, fije las extremidades del ratón a la tabla acrílica ancha con abrazaderas de acero. Con unas tijeras, corte la piel entre los dos fémures y continúe cortando hacia arriba hasta llegar al diafragma. Abra ambos lados del tórax a través del diafragma, usando tijeras y fórceps rectos para exponer el corazón. Inserte una aguja de infusión de 0,7 milímetros conectada a un tubo de perfusión en el ventrículo izquierdo y haga una incisión de uno a dos milímetros en la orejuela auricular derecha. Después de la perfusión, separe la piel de la espalda y la cabeza del ratón con unas tijeras oftálmicas. Corta la columna vertebral en el punto donde la línea que conecta los bordes posteriores superiores de ambas extremidades se cruza con la columna vertebral. Retire el músculo y el tejido graso del cuello y la espalda del ratón para exponer la columna vertebral y el cráneo. Con unas tijeras venosas, corte a lo largo del espacio de la línea media entre los lados izquierdo y derecho de la columna vertebral y la médula espinal desde el extremo inferior del canal vertebral. Luego retire la parte superior y los lados bilaterales de la columna vertebral cortada para exponer la médula espinal. Repite los pasos hasta llegar a la conexión cerebral. Coloque la punta de una hoja de las tijeras venosas entre el foramen magnum y el cerebro. Deslice y corte a lo largo de la sutura sagital media para abrir el cráneo. Use fórceps para extirpar el cráneo y exponer el cerebro. Ahora, con fórceps y tijeras venosas, retire el tejido de la médula espinal del cerebro del ratón del extremo craneal. Use pinzas de disección para extraer la membrana de la médula espinal bajo el microscopio estereoscópico. A continuación, con suturas, asegure la muestra de la médula espinal del cerebro a la placa de fijación. Agregue al menos 20 veces el volumen de muestra de paraformaldehído al 4%. Después de la fijación, deseche el paraformaldehído y lave la muestra tres veces con PBS. Para comenzar, fije la médula espinal del cerebro del ratón extraída en paraformaldehído. Para la solución de eliminación de lípidos, mezcle la solución A y B en una proporción de masa de nueve a uno. Agregue 50 mililitros de la solución de eliminación de lípidos a un tubo de centrífuga de 50 mililitros y coloque el tejido fijo en él. Después de la incubación en la solución C, cambie la solución y coloque la placa de cultivo con la muestra completamente sumergida en la solución C en una caja de luz con una línea de escala. Para preparar la solución en gel, agregue 147 gramos de solución C y tres gramos de agarosa a una botella de vidrio de 200 mililitros. Mezcle bien los componentes con una varilla para revolver, luego cocine en el microondas hasta que la agarosa se disuelva. Transfiera la solución de gel a un horno de laboratorio a 37 grados centígrados. Vierta una capa de dos milímetros de profundidad de una solución de gel templado a 37 grados Celsius en el molde y enfríelo en un refrigerador de cuatro grados Celsius durante 30 minutos hasta que esté semisólido. Coloque la muestra emparejada con índice de refracción en el molde y agregue la solución de gel hasta el nivel o ligeramente por debajo de la parte superior de la muestra. Vuelva a colocar el molde en el refrigerador a cuatro grados centígrados durante dos horas. Cubra con un cubreobjetos y refrigere nuevamente. Retire el cubreobjetos con unas pinzas y saque la muestra incrustada. Agregue 30 mililitros de solución de imágenes a un tubo de 50 mililitros y sumerja la muestra en la solución. Aplique adhesivo 502 para fijar firmemente la muestra en el soporte de la muestra, antes de fijar el soporte en el dispositivo de imágenes. Ejecute el software de escaneo y seleccione el nivel de aumento 4X en la sección de aumento. Haga clic en el botón de calibración para activar el modo de calibración. Haga clic en el botón de vista previa para ingresar al modo de vista previa. A continuación, haga clic en el botón de movimiento de dirección Z para mover lentamente la muestra hacia arriba desde la parte inferior de la cámara de muestras hasta que la hoja de luz generada pase a través de la muestra. Seleccione el canal láser y la opción de modo de iluminación adecuados. Seleccione la dirección de la ruta de exploración para la muestra. Haga clic en el botón de escaneo automático para comenzar a capturar las imágenes de la muestra. El protocolo preservó con éxito todo el cerebro y la médula espinal del ratón mientras mantenía intactas las señales fluorescentes para obtener imágenes claras. Las imágenes fluorescentes de la muestra de la médula espinal del cerebro visualizaron claramente estructuras neuronales detalladas. Las imágenes de mayor aumento proporcionaron una visualización mejorada de las células individuales marcadas con fluorescencia.