Estrategia dual de interferencia CRISPR para atacar interacciones letales sintéticas entre ARN no codificantes en células cancerosas

Nuestro objetivo es identificar sistemáticamente y dirigirse terapéuticamente a los centros críticos de la red, centrándonos en los ARN no codificantes en el cáncer. El desafío experimental actual de nuestro enfoque radica en la capacidad combinatoria requerida para generar y seleccionar grandes cantidades de genes en paralelo. Nuestro objetivo es allanar el camino para identificar nuevas dianas combinatorias de ARN no codificante o estructuras farmacológicas para eludir la resistencia y el escape terapéutico.

En el futuro, traduciremos esta herramienta de prueba de concepto en esfuerzos de cribado de bibliotecas combinatorias a gran escala, potencialmente en combinación con proteínas de unión a ARN, tanto in vitro como in vivo. Para comenzar, cuente las células Lenti-X 293T HEK con colorante azul de tripán en un hemocitómetro. Placa 4 veces 10 a la potencia de 6 células Lenti-X 293T HEK por placa de 10 centímetros e incubar para lograr aproximadamente un 80% de confluencia al día siguiente.

A partir de este paso, trabaje en un laboratorio de clase 2. Mezcle 500 microlitros de un medio de transfección adecuado con vector de transferencia, plásmido de envoltura y vector pPAX2. Incuba la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente.

En un tubo separado, mezcle 500 microlitros de medio sérico reducido con 36 microlitros de reactivo de PEI a una concentración de 1 miligramo por mililitro. Incuba la mezcla durante cinco minutos a temperatura ambiente. Combine las dos mezclas e incube durante 15 minutos a temperatura ambiente.

Ahora, con cuidado, gota a gota, agregue la mezcla al medio celular que contiene seis mililitros e incube durante la noche a 37 grados Celsius en 5% de dióxido de carbono. Después de 12 a 15 horas, deseche el medio en una botella de desecho esterilizable en autoclave con una pipeta serológica. Enjuague los consumibles, incluidas las pipetas serológicas y las puntas de pipeta, con una solución desinfectante antes de desecharlos en la basura del autoclave.

Añada cinco mililitros de DMEM fresco a las células transfectadas con una pipeta nueva. Para recolectar lentivirus, transfiera el sobrenadante con una pipeta serológica a un tubo canónico de 50 mililitros, 48 horas después de la transfección. A continuación, añada 5 mililitros de medio fresco a las células e incubelas durante 24 horas más.

Guarde el tubo en el refrigerador. Después de la incubación, repita la recolección de lentivirus y acompáñela con la muestra recolectada anteriormente. Después de la tercera cosecha, almacene los sobrenadantes combinados de las tres cosechas a cuatro grados centígrados hasta la filtración y centrifugación.

Centrifugar el sobrenadante combinado durante 5 minutos a 500 g y 4 grados centígrados en recipientes herméticos a los aerosoles y rotores aprobados para organismos del Grupo de Riesgo 2, luego filtre el sobrenadante a través de filtros de jeringa estériles de grado de cultivo celular estéril de 0,2 micrómetros. Concentre el sobrenadante filtrado a 1000 g y cuatro grados Celsius utilizando una unidad de filtro centrífugo con un límite de peso molecular de 100 kilodalton a aproximadamente 500 microlitros. Guarde las alícuotas del virus de 50 a 100 microlitros a menos 80 grados centígrados hasta su uso posterior.

Placa de 501 mel celdas en una placa de seis pocillos a 2 por 10 a una potencia de 5 celdas por pocillo con un volumen de cultivo final de 2 mililitros un día antes de la transducción. Sustituya el medio de cultivo por 2 mililitros de DMEM precalentado suplementado con polibreno a una concentración final de 6 microgramos por mililitro. Trabaje en un laboratorio de clase 2 a partir de este paso.

Agregue 50 microlitros de lentivirus SPD y SAD preparados simultáneamente a las células gota a gota. Agite la placa suavemente e incube a 37 grados centígrados en una atmósfera de 5% de dióxido de carbono. 16 horas después de la transducción, deseche el medio en un frasco esterilizable en autoclave con una pipeta serológica.

Agregue 2 mililitros de medio fresco que contenga 10 microgramos por mililitro de blasticidina y 2 microgramos por mililitro de puromicina. Repita el paso de reemplazo del medio después de dos días y manipule las células transducidas en condiciones S1 después de siete días después de la transducción. Siembra 0,1 veces 10 a la potencia de 5 células que contienen SadCas9 KRAB y Sp-dCas9-KRAB transfectados estables siete días después de la transducción en una placa de 96 pocillos con 100 microlitros de DMEM precalentado.

El día de la transducción, reemplace el medio con 100 microlitros de DMEM precalentado suplementado con polibreno a 6 microgramos por mililitro. Agregue el volumen adecuado de lentivirus a las células e incube la placa. Después de 16 horas, reemplace el medio con medio fresco que contenga zeoína, blasticidina y puromicina.

Realice la detección de luminiscencia cinco días después de la transducción utilizando un ensayo de viabilidad celular de acuerdo con las instrucciones del fabricante. El análisis de sangre occidental confirmó la expresión exitosa de las proteínas de fusión SpdCas9 y SadCas9 en células transductoras 501-mel. El análisis cuantitativo de la reacción en cadena de la polimerasa mostró una eliminación efectiva de los ARN largos no codificantes individuales RP11 y XLOC utilizando ARN guía específicos, pero solo el par XLOC-sa y RP11-sp reprimió con éxito ambos objetivos simultáneamente.

La represión dual de RP11 y XLOC utilizando el par XLOC-sa y RP11-sp GRNA redujo significativamente la viabilidad de la célula 501 mel al 59% en comparación con el control.