Name: Estrategia dual de interferencia CRISPR para atacar interacciones letales sintéticas entre ARN no codificantes en células cancerosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprende a utilizar el sistema dual CRISPRi para el silenciamiento combinatorio de lncRNAs en células de melanoma. Este método permite identificar interacciones letales sintéticas y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer.

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<ol><li>Lander, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Initial+sequencing+and+analysis+of+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Initial sequencing and analysis of the human genome.</a> Nature. 409 (6822), 860-921 (2001).</li>
<li>ENCODE Project Consortium. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+integrated+encyclopedia+of+DNA+elements+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">An integrated encyclopedia of DNA elements in the human genome.</a> Nature. 489 (7414), 57-74 (2012).</li>
<li>Szcześniak, M. W., Wanowska, E., Mukherjee, N., Ohler, U., Makałowska, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+deeper+annotation+of+human+lncRNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Gene+Regul+Mech%22%5BJournal%5D)">Towards a deeper annotation of human lncRNAs.</a> Biochim Biophys Acta Gene Regul Mech. 1863 (4), 194385(2020).</li>
<li>Fang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((NONCODEV5%3A+a+comprehensive+annotation+database+for+long+non-coding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Nucl+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">NONCODEV5: a comprehensive annotation database for long non-coding RNAs.</a> Nucl Acids Res. 46 (D1), D308-D314 (2018).</li>
<li>Lin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human-specific+lncRNAs+contributed+critically+to+human+evolution+by+distinctly+regulating+gene+expression%5BTitle%5D)+AND+%22eLife%22%5BJournal%5D)">Human-specific lncRNAs contributed critically to human evolution by distinctly regulating gene expression.</a> eLife. 12, RP89001.2(2023).</li>
<li>Sarropoulos, I., Marin, R., Cardoso-Moreira, M., Kaessmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Developmental+dynamics+of+lncRNAs+across+mammalian+organs+and+species%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Developmental dynamics of lncRNAs across mammalian organs and species.</a> Nature. 571 (7766), 510-514 (2019).</li>
<li>Melé, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+genomics.+The+human+transcriptome+across+tissues+and+individuals%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Human genomics. The human transcriptome across tissues and individuals.</a> Science. 348 (6235), 660-665 (2015).</li>
<li>Cabili, M. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Integrative+annotation+of+human+large+intergenic+noncoding+RNAs+reveals+global+properties+and+specific+subclasses%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Integrative annotation of human large intergenic noncoding RNAs reveals global properties and specific subclasses.</a> Genes Dev. 25 (18), 1915-1927 (2011).</li>
<li>Liu, S. J., Dang, H. X., Lim, D. A., Feng, F. Y., Maher, C. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Long+noncoding+RNAs+in+cancer+metastasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Long noncoding RNAs in cancer metastasis.</a> Nat Rev Cancer. 21 (7), 446-460 (2021).</li>
<li>Ahmad, M., Weiswald, L. B., Poulain, L., Denoyelle, C., Meryet-Figuiere, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Involvement+of+lncRNAs+in+cancer+cells+migration%2C+invasion+and+metastasis%3A+cytoskeleton+and+ECM+crosstalk%5BTitle%5D)+AND+%22J+Exp+Clin+Cancer+Res%22%5BJournal%5D)">Involvement of lncRNAs in cancer cells migration, invasion and metastasis: cytoskeleton and ECM crosstalk.</a> J Exp Clin Cancer Res. 42 (1), 173(2023).</li>
<li>Jain, A. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LncPRESS1+Is+a+p53-Regulated+LncRNA+that+Safeguards+Pluripotency+by+Disrupting+SIRT6-Mediated+De-acetylation+of+Histone+H3K56%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LncPRESS1 Is a p53-Regulated LncRNA that Safeguards Pluripotency by Disrupting SIRT6-Mediated De-acetylation of Histone H3K56.</a> Mol Cell. 64 (5), 967-981 (2016).</li>
<li>Bergmann, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+the+ESC+transcriptome+by+nuclear+long+noncoding+RNAs%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of the ESC transcriptome by nuclear long noncoding RNAs.</a> Genome Res. 25 (9), 1336-1346 (2015).</li>
<li>Kretz, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Control+of+somatic+tissue+differentiation+by+the+long+non-coding+RNA+TINCR%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Control of somatic tissue differentiation by the long non-coding RNA TINCR.</a> Nature. 493 (7431), 231-235 (2013).</li>
<li>Yoon, J. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((LincRNA-p21+suppresses+target+mRNA+translation%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">LincRNA-p21 suppresses target mRNA translation.</a> Mol Cell. 47 (4), 648-655 (2012).</li>
<li>Huarte, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+emerging+role+of+lncRNAs+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Med%22%5BJournal%5D)">The emerging role of lncRNAs in cancer.</a> Nat Med. 21 (11), 1253-1261 (2015).</li>
<li>Badowski, C., He, B., Garmire, L. X. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blood-derived+lncRNAs+as+biomarkers+for+cancer+diagnosis%3A+the+Good%2C+the+Bad+and+the+Beauty%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Precis+Oncol%22%5BJournal%5D)">Blood-derived lncRNAs as biomarkers for cancer diagnosis: the Good, the Bad and the Beauty.</a> NPJ Precis Oncol. 6 (1), 40(2022).</li>
<li>Zong, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Knockdown+of+nuclear-retained+long+noncoding+RNAs+using+modified+DNA+antisense+oligonucleotides%5BTitle%5D)+AND+%22Meth+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Knockdown of nuclear-retained long noncoding RNAs using modified DNA antisense oligonucleotides.</a> Meth Mol Biol. 1262, 321-331 (2015).</li>
<li>Gagnon, K. T., Li, L., Chu, Y., Janowski, B. A., Corey, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNAi+factors+are+present+and+active+in+human+cell+nuclei%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">RNAi factors are present and active in human cell nuclei.</a> Cell Rep. 6 (1), 211-221 (2014).</li>
<li>Zeng, Y., Cullen, B. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((RNA+interference+in+human+cells+is+restricted+to+the+cytoplasm%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">RNA interference in human cells is restricted to the cytoplasm.</a> RNA. 8 (7), 855-860 (2002).</li>
<li>Yang, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR%2FCas9-mediated+noncoding+RNA+editing+in+human+cancers%5BTitle%5D)+AND+%22RNA+Biol%22%5BJournal%5D)">CRISPR/Cas9-mediated noncoding RNA editing in human cancers.</a> RNA Biol. 15 (1), 35-43 (2018).</li>
<li>Liu, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi-based+genome-scale+identification+of+functional+long+noncoding+RNA+loci+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">CRISPRi-based genome-scale identification of functional long noncoding RNA loci in human cells.</a> Science. 355 (6320), aah7111(2017).</li>
<li>Tsung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPRi+screen+of+long+non-coding+RNAs+identifies+LINC03045+regulating+glioblastoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Genet%22%5BJournal%5D)">CRISPRi screen of long non-coding RNAs identifies LINC03045 regulating glioblastoma invasion.</a> PLoS Genet. 20 (6), e1011314(2024).</li>
<li>Gilbert, L. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-mediated+modular+RNA-guided+regulation+of+transcription+in+eukaryotes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">CRISPR-mediated modular RNA-guided regulation of transcription in eukaryotes.</a> Cell. 154 (2), 442-451 (2013).</li>
<li>Boettcher, M., McManus, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Choosing+the+right+tool+for+the+job%3A+RNAi%2C+TALEN%2C+or+CRISPR%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Choosing the right tool for the job: RNAi, TALEN, or CRISPR.</a> Mol Cell. 58 (4), 575-585 (2015).</li>
<li>Yeo, N. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+enhanced+CRISPR+repressor+for+targeted+mammalian+gene+regulation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">An enhanced CRISPR repressor for targeted mammalian gene regulation.</a> Nat Meth. 15 (8), 611-616 (2018).</li>
<li>Parrish, P. C. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Discovery+of+synthetic+lethal+and+tumor+suppressor+paralog+pairs+in+the+human+genome%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Discovery of synthetic lethal and tumor suppressor paralog pairs in the human genome.</a> Cell Rep. 36 (9), 109597(2021).</li>
<li>Najm, F. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orthologous+CRISPR-Cas9+enzymes+for+combinatorial+genetic+screens%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Orthologous CRISPR-Cas9 enzymes for combinatorial genetic screens.</a> Nat Biotechnol. 36 (2), 179-189 (2018).</li>
<li>Petroulia, S., et al. CRISPR-inhibition screen for lncRNAs linked to melanoma growth and metastasis. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPetroulia%2C+S+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Hsu, P. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+targeting+specificity+of+RNA-guided+Cas9+nucleases%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">DNA targeting specificity of RNA-guided Cas9 nucleases.</a> Nat Biotechnol. 31 (9), 827-832 (2013).</li>
<li>New England Biolabs. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22NEBuilder+HiFi+DNA+Assembly+Reaction+%28E2621%29+v2%22">NEBuilder HiFi DNA Assembly Reaction (E2621) v2</a>. , (2020).</li>
<li>Cortés-Ríos, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+quantification+by+bicinchoninic+acid+%28BCA%29+assay+follows+complex+kinetics+and+can+be+performed+at+short+incubation+times%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Protein quantification by bicinchoninic acid (BCA) assay follows complex kinetics and can be performed at short incubation times.</a> Anal Biochem. 608, 113904(2020).</li>
<li>Junior, N. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aJunior%2C+N+%22Polyacrylamide+Gel+Electrophoresis+%28SDS-PAGE%29+v1%22">Polyacrylamide Gel Electrophoresis (SDS-PAGE) v1</a>. , (2019).</li>
<li>Chen, X., Liu, J., Janssen, J. M., Gonçalves, M. A. F. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+chromatin+structure+differentially+impacts+high-specificity+CRISPR-Cas9+Nuclease+strategies%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Ther+Nucl+Acids%22%5BJournal%5D)">The chromatin structure differentially impacts high-specificity CRISPR-Cas9 Nuclease strategies.</a> Mol Ther Nucl Acids. 8, 558-563 (2017).</li>
<li>Schep, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Impact+of+chromatin+context+on+Cas9-induced+DNA+double-strand+break+repair+pathway+balance%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Cell%22%5BJournal%5D)">Impact of chromatin context on Cas9-induced DNA double-strand break repair pathway balance.</a> Mol Cell. 81 (10), 2216-2230.e10 (2021).</li>
<li>Daer, R. M., Cutts, J. P., Brafman, D. A., Haynes, K. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+impact+of+chromatin+dynamics+on+Cas9-Mediated+genome+editing+in+human+cells%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Syn+Biol%22%5BJournal%5D)">The impact of chromatin dynamics on Cas9-Mediated genome editing in human cells.</a> ACS Syn Biol. 6 (3), 428-438 (2017).</li>
<li>Chavez, M., Rane, D. A., Chen, X., Qi, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Stable+expression+of+large+transgenes+via+the+knock-in+of+an+integrase-deficient+lentivirus%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Stable expression of large transgenes via the knock-in of an integrase-deficient lentivirus.</a> Nat Biomed Eng. 7 (5), 661-671 (2023).</li>
<li>Ellis, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Silencing+and+variegation+of+gammaretrovirus+and+lentivirus+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Human+Gene+Ther%22%5BJournal%5D)">Silencing and variegation of gammaretrovirus and lentivirus vectors.</a> Human Gene Ther. 16 (11), 1241-1246 (2005).</li>
<li>Shrestha, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomics+and+epigenetics+guided+identification+of+tissue-specific+genomic+safe+harbors%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">Genomics and epigenetics guided identification of tissue-specific genomic safe harbors.</a> Genome Biol. 23 (1), 199(2022).</li>
<li>Chu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Enhanced+gene+transfection+and+induction+of+apoptosis+in+melanoma+cells+by+branched+poly%28%CE%B2-amino+ester%29s+with+uniformly+distributed+branching+units%5BTitle%5D)+AND+%22J+Control+Release%22%5BJournal%5D)">Enhanced gene transfection and induction of apoptosis in melanoma cells by branched poly(β-amino ester)s with uniformly distributed branching units.</a> J Control Release. 367, 197-208 (2024).</li>
<li>Han, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nucleofection+is+a+highly+effective+gene+transfer+techfnique+for+human+melanoma+cell+lines%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Dermatol%22%5BJournal%5D)">Nucleofection is a highly effective gene transfer techfnique for human melanoma cell lines.</a> Exp Dermatol. 17 (5), 405-411 (2008).</li>
</ol>

Aunque menos del 3% del genoma humano codifica proteínas, aproximadamente el 80% del genoma está transcrito 1,2. Entre las unidades transcripcionales no codificantes, decenas de miles se clasifican como ARN largos no codificantes (lncRNA) que superan los 200 nucleótidos, y se estima que el número total de lncRNAs humanos supera los 100.000 3,4. A diferencia de los genes codificantes, los lncRNAs están menos conservados en todas las especies. Dado que los humanos comparten el 99% de su genoma con primates como los chimpancés, se plantea la hipótesis de que los lncRNAs tienen una influencia mucho mayor en la evolución fenotípica 5,6. Estos hallazgos indican importantes funciones celulares de los lncRNAs. Aunque la regulación de los lncRNAs y sus interacciones con las proteínas de unión al ARN y otros ARN sigue sin comprenderse completamente, y muchos lncRNAs aún no se han anotado completamente, está claro que los lncRNAs exhiben patrones de expresión específicos de células y tejidos en la salud y la enfermedad, como el cáncer 7,8,9,10. Están implicados en diversas funciones, incluida la regulación de la transcripción génica, la participación en las interacciones de la cromatina11, el procesamiento del ARN12, la estabilización del ARN13 y la regulación de la traducción14.
En el cáncer, los lncRNAs específicos de un tipo de célula muy diversos influyen en el desarrollo tumoral y la metástasis mediante la regulación de la expresión génica, lo que pone de manifiesto su potencial como dianas terapéuticas valiosas15. Más allá de la detección de lncRNAs como biomarcadores en muestras tumorales16, dirigirse a lncRNAs específicos del tumor para interrumpir sus funciones posteriores tiene un potencial significativo tanto en aplicaciones clínicas como en investigación básica. Los enfoques basados en ARN para dilucidar las funciones de los lncRNAs incluyen oligonucleótidos antisentido (ASO), ARN de horquilla corta y ARN interferentes pequeños (siRNAs)17,18. Si bien el siRNA se utiliza comúnmente para las pantallas de silenciamiento de genes, la eliminación basada en siRNA se restringe al citoplasma19. Sin embargo, el lncRNA opera con frecuencia dentro del núcleo.
Alternativamente, la interferencia de repeticiones palindrómicas cortas agrupadas regularmente interespaciadas (CRISPRi) se puede utilizar para inhibir los lncRNAs en cánceres humanos20. Además, las pantallas CRISPRi de todo el genoma pueden programarse fácilmente y dirigirse a una amplia gama de genes codificantes y no codificantes para examinar su impacto funcional21,22. En CRISPRi, un Cas9 catalítico deficiente (dCas9) se fusiona con un dominio represor transcripcional, como el dominio23 de la caja asociada a Krüppel (KRAB). La represión génica por dCas9-KRAB es guiada por un ARN guía (ARNg) a la región de interés. CRISPRi controla los genes a nivel del ADN, lo que conduce a una mayor eficiencia y a los fenotipos deseados de pérdida de función, en contraste con la interferencia del ARN, que está activa en el nivel postranscripcional24. En respuesta a la limitada eficacia de KRAB en el silenciamiento de dianas, se introdujo una fusión de KRAB y MeCP2 con dCas9 como una estrategia de represión más efectiva25.
Aunque el silenciamiento de un solo gen puede afectar la viabilidad del cáncer, las interacciones letales sintéticas, duales o múltiples, pueden rescatar a las células cancerosasde la muerte celular. La letalidad sintética involucra dos o más genes, cada uno de los cuales puede compensar la función del otro. Para superar los problemas con las pantallas de eliminación de un solo gen, las estrategias duales de CRISPR dirigidas a pares de genes letales que codifican proteínas ofrecen un enfoque prometedor27.
Aquí, presentamos un protocolo para el uso combinatorio de la focalización ortogonal basada en CRISPRi de lncRNA u otros pares de ARN no codificantes utilizando Staphylococcus aureus y Streptococcus pyogenes dCas9 fusionados con KRAB-MeCP2 en células de melanoma humano (ver Figura 1). El protocolo se puede utilizar para la eliminación combinada de CRISPR clásico o como detección basada en CRISPRi de pares letales sintéticos en el cáncer. El uso de dos especies diferentes de dCas9, SpCas9 y SaCas9, en el enfoque CRISPRi permite la orientación independiente de distintos loci genómicos con una reactividad cruzada mínima, lo que mejora la especificidad y la flexibilidad, al tiempo que garantiza una alta selectividad en el objetivo. Se utilizan diferentes motivos adyacentes protoespaciadores (PAMs): NGG para SpCas9 y NNGRRT para SaCas9. El sistema dual dCas9 aborda desafíos como la compatibilidad limitada de sgRNA al permitir una modulación precisa y simultánea y reducir la competencia compleja sgRNA-RNP cuando se usa un solo tipo de dCas9. Esta innovación mejora la robustez y versatilidad del cribado de bibliotecas duales de sgRNA. En conclusión, proporcionamos un sistema CRISPRi dual completamente funcional en células de melanoma como modelo de cáncer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema del sistema dual CRISPRi para dirigirse a las interacciones letales sintéticas de ARN no codificantes. (A) Procedimiento de clonación del vector dual de ARNg. (B) Las células HEK293 se transfectaron con el plásmido de envoltura VSV-G, el plásmido de empaquetamiento PAX2 y el vector de transferencia para producir lentivirus para su posterior transducción a células de 501 mel. Los lentivirus que contenían la información genética de SpdCas9-KRAB-MeCP2 (azul) y SadCas9-KRAB-MeCP2 (rojo) se integraron simultáneamente en células de 501 mel. Tras la selección del antibiótico, se realizó una segunda transducción lentiviral para integrar los gRNAs duales deseados (verde oliva). (C) Las células 501-mel que expresan las variantes dCas9 interactúan con sus ARNg correspondientes para silenciar la expresión génica diana, lo que resulta en la muerte de las células cancerosas. Creado con BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Filtro ultracentrífugo Amicon, 100 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal de ratón anti-Cas9 (S. aureus) (6H4)</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) anticuerpo monoclonal</td><td>Tecnología de señalización celular</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>anticuerpo monoclonal de ratón anti-GAPDH&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Ratón IgG (molécula entera)&ndash; Anticuerpo peroxidasa producido en conejo</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Blasticidina S clorhidrato Sigma</td><td>Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensayo de viabilidad de células luminiscentes</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema de detección de PCR en tiempo real</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sustrato Clarity Western ECL, 500 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de CO2 modelo CB 170</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Cóctel de inhibidores de proteasa</td><td>Roche</td><td>11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmB1) Enzima de restricción</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL Pipeta serológica</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25 mL Pipeta Serológica</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Pipeta Serológica</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Fetal Bovino</td><td>Suero Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' Águila modificada' s medio (DMEM), glucosa alta, piruvato</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>La línea celular de melanoma humano 501-mel</td><td>fue amablemente proporcionada por el Laboratorio Aifantis (Universidad de Nueva York)</td><td>RRID: CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Membrana de PVDF Immobilon -P</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T Línea celular HEK</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Sistema de células trans-transferencias&nbsp;</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Mini-PROTEAN Tetra Sistema de fundición a mano</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi Reacción de ensamblaje de ADN&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Leche descremada en polvo&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampón de muestra (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl E. coli químicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Medio de suero reducido</td><td>Gibco</td><td>31985062</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de PCR 0,5 ml (tapa plana)</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion Mezcla maestra de PCR de alta fidelidad con tampón HF</td> Kit de ensayo de proteínas BCA <td>Thermo Scientific</td><td>F531L</td><td></td></tr><tr><td>Pierce&nbsp;</td><td>Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina, ramificada</td><td>Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td></tr><tr><td>Dihidroclorhidrato de puromicina</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de purificación&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal Tubo de microcentrífuga 1,5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72.706</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de sodio, 5 M Aqua Solution, sin RNasa</td><td>Alfa Aesar</td><td>J60434.AE</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de sodio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de jeringa PES 33mm 0,2 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC Dish 100, Estándar</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC Placa 6 Pocillos, Estándar, F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Tris base</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

estrategia dual de interferencia crispr para atacar interacciones letales sintéticas entre arn no codificantes en células cancerosas

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

Los casetes de expresión de SadCas9-KRAB-MeCP2 y SpdCas9-KRAB-MeCP2 se integraron simultáneamente en células de 501 mel utilizando transducción con cantidades iguales de lentivirus. Dado que este protocolo CRISPRi se basa en la expresión de variantes de dCas9-KRAB-MeCP2, el análisis de Western blot es ideal para confirmar su presencia a nivel de proteína. Tras el enriquecimiento de las células transfectadas positivamente, se recogieron muestras para el análisis de Western blot con el fin de confirmar la presencia de los ortólogos dCas9-KRAB-MeCP2. Tras una transducción exitosa, se espera una sola banda correspondiente a la proteína de fusión SpdCas9-KRAB-MeCP2 (202 kDa) y la proteína de fusión SadCas9-KRAB-MeCP2 (170 kDa) y se confirmó, como se muestra en la Figura 2A, utilizando anticuerpos específicos para los ortólogos Cas9 respectivos. Sin embargo, si la transferencia de Western no es factible, se puede utilizar la qPCR para verificar las proteínas de fusión a nivel de ARNm.
Una vez que se generaron células de 501 mel que expresaban de manera estable los represores funcionales, se realizó una segunda transducción lentiviral utilizando un vector de ARNg dual. Previamente se demostró que RP11 y XLOC estaban regulados al alza en cultivos a corto plazo de melanoma metastásico, y la focalización individual de CRISPRi demostró su impacto en la proliferación y la supervivencia celular28. Por lo tanto, seleccionamos este par de lncRNA para su evaluación como una combinación de ARN no codificante letal sintético de prueba de concepto, anticipando un fenotipo de crecimiento acumulativo y fácilmente observable en las células modificadas.
Para investigar los efectos de CRISPRi dual en células cancerosas mediante ensayos de viabilidad, ambos lncRNAs dirigidos deben ser reprimidos de manera efectiva. La qPCR es el método más adecuado para confirmar esta represión mediante la medición de sus niveles de transcripción. Evaluamos la funcionalidad del protocolo dual CRISPRi desarrollado mediante la determinación de los niveles de ARN y el examen de la viabilidad celular cuando se dirige al par RP11 y XLOC potencialmente letal. Por lo tanto, se introdujeron diferentes ARNg dirigidos a RP11 y XLOC para reducir los niveles de ARN diana. La represión del ARN se investigó utilizando ARNg específicos de la diana para SadCas9-KRAB-MeCP2 o SpdCas9-KRAB-MeCP2, probados individualmente y en combinación junto con un ARNg de control dirigido a Rosa26 (ver Figura 2B). Aunque los ARNg dirigidos a XLOC o RP11 individualmente suprimieron eficazmente sus respectivos objetivos, la eliminación simultánea de XLOC y RP11 solo se logró con el par XLOC-sa/RP11-sp.
Dado que los niveles de ARN XLOC y RP11 se redujeron con éxito en la línea celular de 501 mel con el par de ARNg XLOC-sa/RP11-sp seleccionado, se realizó un ensayo de viabilidad de represión de ARNl dual (ver Figura 2C). A los 5 días, la viabilidad celular fue del 81% y del 89% del control Rosa26 cuando se utilizaron los ARNg diana individualmente. La combinación de RP11-sp y XLOC-sa dio lugar a una reducción significativa adicional en comparación con RP11-sp solo, con una viabilidad celular del 59% del control Rosa26.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg"> 
Figura 2: Funcionalidad del sistema dual de represión de lncRNA. (A) Se realizó un análisis de Western blot para detectar las variantes de dCas9-KRAB-MeCP2 en células 501-mel modificadas utilizando anticuerpos anti-Cas9. Se utilizaron células de tipo salvaje (WT) de 501 mel sin transducción como control (véase la Figura suplementaria 3, la Figura suplementaria 4, la Figura suplementaria 5, la Figura suplementaria 6 para el blot sin procesar). (B) análisis basado en qPCR de los niveles de ARN RP11 y XLOC en relación con las células de control Rosa26 después de la transducción de ARNg duales en células 501-mel modificadas. Se utilizó GAPDH como gen de limpieza. Los datos se expresan como media ± DE. (C) El ensayo de viabilidad de represión de ARNc dual se realizó después de integrar ARNg duales en células 501 mel modificadas en tres transducciones independientes. Los valores de luminiscencia se normalizaron al control Rosa26. Los resultados de viabilidad se expresan como la media (n = 3) ± SEM. Se realizó una prueba t no apareada. El asterisco (*) indica una diferencia significativa a p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Mapa de plásmidos. El mapa fue creado con Benchling (https://benchling.com/). Los plásmidos utilizados en el protocolo fueron modificados a partir de Addgene #96921 y #110824. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 2: Figura suplementaria 2: Análisis de Western blot de Expresión dCas9-KRAB. (A) Expresión de SadCas9-KRAB en células de 501 mel 6 días después de la transfección. (B) La transducción secuencial de SadCas9-KRAB y SpdCas9-KRAB en células de 501 mel condujo a una reducción de la expresión de SadCas9-KRAB 3 semanas después de la transfección. (C) La transducción simultánea de SadCas9-KRAB y SpdCas9-KRAB en células de 501 mel resultó en una reducción de la expresión de SadCas9-KRAB 3 semanas después de la transfección. (D) La expresión de SpdCas9-KRAB pudo observarse después de la transducción simultánea de SadCas9-KRAB y SpdCas9-KRAB. LV. El volumen de lentivirus utilizados en μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura suplementaria 3: Datos brutos de Western blot SaCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 4: Datos brutos de Western blot SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 5: Datos brutos de GAPDH_SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 6: Datos brutos de GAPDH_SaCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 1: Secuencias de ARN guía utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Tabla complementaria 2: Secuencias de ADN utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario 1: Fichero FASTA de dual-grna-zeo-gfp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario 2: Fichero FASTA de dSpCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Fichero complementario 3: Fichero FASTA de dSaCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Estrategia dual de interferencia CRISPR para atacar interacciones letales sintéticas entre ARN no codificantes en células cancerosas

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

CRISPR/Cas9 es un sistema robusto para producir disrupción de genes y elementos genéticos. En este trabajo describimos un protocolo para la creación eficiente de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos utilizando CRISPR/Cas9.

Generación de deleciones genómicas en líneas celulares de mamíferos a través de CRISPR / Cas9

Los recientes avances en la capacidad de manipular genéticamente las líneas celulares somáticas tienen un gran potencial para la investigación básica y aplicada. En este sentido, presentamos dos enfoques para CRISPR / Cas9 generado producción de eliminación y el cribado en líneas de células de mamíferos, con y sin el uso de marcadores seleccionables.

Generación dependiente de la selección y independiente de CRISPR / Cas9-mediada Gene Knockouts en células de mamíferos

Este protocolo describe el flujo de trabajo de un gen CRISPR/Cas9 basado en sistema para la reparación de las mutaciones de punto en células de mamíferos. Aquí, utilizamos un enfoque combinatorio gene edición con una detallado seguimiento estrategia experimental para medir la formación de indel en el sitio de destino, en esencia, analizar in situ la mutagénesis.

Una metodología estándar para examinar in situ mutagenicidad en función de la mutación de punto reparación catalizada por CRISPR/Cas9 y SsODN en células humanas

Este protocolo describe los pasos necesarios para diseñar y realizar targeting multiplexados de potenciadores con la desactivación proteína de fusión SID4X-dCas9-Cascarudo, también conocido como interferencia de enhancer (potenciador-i). Este protocolo permite la identificación de los reforzadores que regulan la expresión génica y facilita la disección de las relaciones entre los potenciadores de regulación de un gen de destino común.

Disección de la función del reforzador mediante Multiplex basados en CRISPR potenciador de interferencia en líneas celulares

La entrega directa de complejos de ribonucleoproteínacas Cas9/ARN guía premontados es un medio rápido y eficiente para la edición del genoma en células hematopoyéticas. Aquí, utilizamos este enfoque para eliminar un silenciador intrónico RUNX1 y examinar las respuestas transcripcionales en las células leucémicas OCI-AML3.

Investigación del papel transcripcional de un silenciador intrónico RUNX1 por RIBonucleoprotein CRISPR/Cas9 en células de leucemia mieloide aguda

Las pantallas genéticas grandes en organismos modelo han llevado a la identificación de interacciones genéticas negativas. Aquí, describimos un flujo de trabajo de integración de datos utilizando datos de pantallas genéticas en organismos modelo para delinear combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas en el cáncer.

Un flujo de trabajo de integración de datos para identificar combinaciones de fármacos dirigidas a interacciones letales sintéticas

Este protocolo describe un flujo de trabajo de edición de genes de repeticiones palindrómicas cortas (CRISPR) agrupadas regularmente interespaciadas de alto rendimiento para el análisis de redes de clústeres de microARN que permite la generación rápida de un panel de líneas celulares modificadas genéticamente que llevan combinaciones únicas de eliminación de miembros de grupos de miRNA de hasta 35 kb dentro de un solo experimento.

Herramienta de edición de genes CRISPR para el análisis de redes de clústeres de microARN

Un obstáculo importante para tecnologías como CRISPR son los eventos fuera del objetivo que pueden alterar genes vitales. La «circularización para la notificación in vitro de los efectos de la escisión mediante secuenciación» (CIRCLE-seq) es una técnica diseñada para identificar los sitios de escisión no intencionados. Este método mapea la actividad de CRISPR-Cas9 en todo el genoma con alta sensibilidad y sin sesgos.

CIRCLE-SEQ para la interrogación de la edición de genes fuera del objetivo

La línea celular THP-1 se utiliza ampliamente como modelo para investigar las funciones de los monocitos/macrófagos humanos en diversas áreas de investigación relacionadas con la biología. Este artículo describe un protocolo para la ingeniería eficiente basada en CRISPR-Cas9 y el aislamiento de clones de una sola célula, lo que permite la producción de datos fenotípicos robustos y reproducibles.

Knockout génico mediado por CRISPR-Cas9 basado en electroporación en células THP-1 y aislamiento de clones de una sola célula

Se ofrece un enfoque meticuloso y estructurado para seleccionar genes resistentes y sensibles a la radiación mediante la aplicación de un método de cribado CRISPR/Cas9 de todo el genoma. Este protocolo también tiene el potencial de servir como un marco versátil para otros esfuerzos de investigación que investigan los mecanismos de resistencia a los medicamentos químicos administrados clínicamente.

Cribado CRISPR de todo el genoma para revelar genes radiosensibles y radiorresistentes

Aprende a utilizar el sistema dual CRISPRi para el silenciamiento combinatorio de lncRNAs en células de melanoma. Este método permite identificar interacciones letales sintéticas y desarrollar nuevas estrategias terapéuticas contra el cáncer.

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