Un método eficiente para extraer epitelios de trompas de Falopio humanas para análisis de células individuales

Nuestro enfoque de investigación es comprender y combatir la resistencia a la quimioterapia en los cánceres de ovario. Nuestro objetivo es descubrir mecanismos y subpoblaciones celulares que impulsan la resistencia y nuevos objetivos para erradicar estas poblaciones agresivas.

La secuenciación de ARN unicelular facilita la caracterización de subpoblaciones en tumores ováricos heterogéneos. Aprovechamos las células epiteliales de las trompas de Falopio no cancerosas como una célula de origen normal para los análisis de cáncer de ovario.

El aislamiento eficiente de las células epiteliales de las trompas de Falopio en una suspensión unicelular enriquecida ayudará a comprender mejor el inicio de la enfermedad de cáncer de ovario seroso de alto grado. Esta técnica de digestión mecánica y enzimática ofrece un proceso más eficiente para extraer una suspensión unicelular enriquecida de células epiteliales viables de las trompas de Falopio.

[Narrador] Para comenzar, recolecte trompas de Falopio humanas frescas en un tubo de 15 o 50 mililitros que contenga medios de disociación y coloque el tubo en hielo. Transfiera las trompas de Falopio a una placa de Petri estéril que contenga medios de disociación frescos y coloque la muestra bajo un microscopio de disección. Ahora, con pinzas de punta fina y tijeras Vannas-Tubingen, disecciona la grasa, el tejido conectivo y los vasos que rodean las trompas. Luego, corte el plano coronal de las trompas de Falopio con unas tijeras para formar pequeños cilindros de tres a cinco milímetros de diámetro. Use fórceps finos = de punta para estabilizar el tejido mientras corta. Aspire con cuidado el medio de disociación del plato que contiene los trozos de tejido. Lave las piezas de tejido dos veces con dos mililitros de PBS frío 1x y gire ligeramente la placa. Después de aspirar el PBS, incube las piezas de tejido durante cinco minutos en EDTA frío de cinco milimolares a temperatura ambiente. Suspender los fragmentos de tejido en una solución salina equilibrada fría de tripsina Hanks e incubar a cuatro grados centígrados durante 40 minutos. Aspire la solución salina equilibrada de tripsina Hanks al 1% y lave los trozos de tejido dos veces en medios de disociación en frío para inactivar la tripsina. Incube los fragmentos de tejido en dos mililitros de medio de disociación con 0,4 miligramos de ADNasa durante al menos 30 minutos a temperatura ambiente. Bajo un microscopio de disección mientras aún está en medio de ADNasa, sostenga un fragmento de la trompa de Falopio con fórceps para que la luz quede paralela al fondo del plato. Use fórceps para presionar repetidamente el tejido para expulsar las células epiteliales de la luz. Confirme la liberación de un halo de células alrededor del tejido. Transfiera las células que contienen medios a un tubo estéril de 15 mililitros. Lave la placa de Petri dos veces con medios de disociación y combine los lavados en el mismo tubo. Deseche los fragmentos restantes del tubo estromal. Para cosechar las células, centrifugarlas a 500 g durante cinco minutos. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento en un mililitro de medio de disociación. Ahora, mezcle 10 microlitros de suspensión celular con un volumen igual de azul de tripano. Pipetee 10 microlitros de la mezcla en un portaobjetos de recuento de cámara e insértelo en un contador de células para determinar el recuento de células. Resuspender las células en nueve mililitros de medios de disociación que contienen colagenasa tipo uno y ADNasa. Incube a 37 grados Celsius durante 30 a 45 minutos en un agitador orbital a 200 RPM. Para cosechar las células, centrifugar a 500 g durante cinco minutos. Después de aspirar el sobrenadante, vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de medio de disociación para eliminar la colagenasa. Pasar la suspensión celular a través de un colador celular de 100 micrómetros en un tubo de 50 mililitros y centrifugar el filtrado a 500 g durante cinco minutos. Si el sedimento celular aparece rojo, prepare un tampón de lisis de glóbulos rojos para lisar los glóbulos rojos. Aspire el medio del gránulo, agregue cinco mililitros del tampón de lisis de glóbulos rojos diluido e incube la muestra en hielo durante tres minutos. Para detener la lisis de glóbulos rojos, agregue 45 mililitros de 1x PBS al tubo. Centrifugar el tubo a 500g durante cinco minutos. Después de recolectar y volver a suspender las células en un mililitro de medio de disociación, mezcle 10 microlitros de la suspensión celular con un volumen igual de azul de tripano. Pipetee 10 microlitros de la mezcla en un portaobjetos de recuento de cámara e insértelo en el contador de células. El análisis de citometría de flujo confirmó el aislamiento de una población de células epiteliales viables y enriquecidas del tejido de las trompas de Falopio con una viabilidad promedio del 82%. Después de extraer las células inmunitarias CD45 positivas, las células epiteliales positivas para EpCAM comprendieron un promedio del 80% de la muestra, mientras que la contaminación de células estromales CD10 positivas fue mínima en un 7,8%. Las células epiteliales aisladas formaron grupos adherentes en forma de adoquines en cultivo 2D después de cuatro a seis días de siembra, lo que confirma la identidad epitelial. La inmunoquímica reveló que la mayoría de las células cultivadas expresaban EpCAM y PAX8 con solo unas pocas células positivas para vimentina. Las células ciliadas estaban presentes en cultivo.