Método de alto rendimiento para observar fenotipos de motilidad en Pseudomonas aeruginosa

Nuestra investigación se centra en comprender cómo funcionan las bacterias y cómo causan infecciones utilizando la biología de sistemas y la genómica. Nuestro objetivo es identificar los genes que influyen en la fisiología bacteriana en condiciones que imitan el entorno de infección para encontrar nuevos objetivos que permitan desarrollar mejores antibióticos y tratamientos alternativos. Desarrollamos un protocolo de alto rendimiento para identificar factores genéticos que influyen en la motilidad de Pseudomonas aeruginosa, permitiendo el análisis genómico de comportamientos de enjambre y espasmos. Esta iniciativa investigadora descubrió mecanismos moleculares que impulsan la motilidad y que también contribuyen a la formación de biofilm, colonización y evasión de la defensa del huésped.

Es adaptable a diferentes ensayos y especies bacterianas. Para empezar, toma las planchas fuente de la biblioteca mutante transposón de Pseudomonas aeruginosa y déjalas planas sobre una superficie a temperatura ambiente durante aproximadamente una hora para que se enfríen. Para el ensayo deseado, selecciona placas de glucosa M9 al 0,5% de agar para enjambre y placas LB agar al 1% de ágar para espasmos.

Para configurar el replicador para una transferencia precisa de la colonia, enciéndelo. En la sección seleccionar y operar modo, elegir seleccionar y ejecutar programas almacenados. En la sección selecciona matrículas de origen, selecciona más lámina 384 agar.

Luego, en la sección de seleccionar placa objetivo, selecciona más lámina 384 agar. En la sección selecciona almohadillas, selecciona el pin corto 384. En los programas de cantante, selecciona replicar muchos, luego ir a replicar opciones de programa y elegir general, reciclar y ninguno.

En la fuente de la sección, selecciona desplazamiento, luego radio aleatorio y por defecto. En el objetivo de la sección, selecciona fijación y ajusta la presión a 2%. Deja todos los demás ajustes como predeterminados. Luego, inserta el pasador corto RePads 384 en el compartimento correspondiente.

Coloca las placas fuente y objetivo en la plataforma designada del replicador. Coloca las placas fuente de densidad 384 y las placas vacías de motilidad sobre la plataforma. Pulsa ejecutar usando los parámetros seleccionados para iniciar el proceso de transferencia.

El robot de fijación de matrices microbianas transferirá colonias de las placas fuente de densidad 384 a las placas de motilidad. Después, coloca las placas de motilidad inoculadas en bolsas de plástico. Coloca cuidadosamente las bolsas que contienen las placas en la incubadora, ajustadas a 37 grados Celsius durante 18 horas.

Tras el periodo de incubación, capturar imágenes de alta resolución de las placas de motilidad utilizando cualquier software de imagen de alta calidad. Después de realizar el ensayo de motilidad e imaginar las placas de motilidad, ejecuta el macro en ImageJ. Abre la carpeta que contiene las imágenes para cargar el lote y analizarlo.

Cuando se lo pida, modifica el ángulo usando la opción de vista previa hasta que la placa quede recta para ajustar la rotación de la placa. Cuando estés satisfecho, haz clic en el botón de aceptar. Luego, mueve la herramienta rectangular alrededor de las colonias para recortar la parte de la placa que contiene las colonias.

Cuando esté listo, haz clic en aceptar para completar el recorte. Define la cuadrícula utilizada para dibujar la región de interés, o ROI, alrededor de cada colonia y mide el área de motilidad. Selecciona la densidad de colonias adecuada y ajusta los parámetros según sea necesario para asegurar que cada círculo esté posicionado alrededor de la colonia.

Cuando estés listo, activa la caja de aceptar y haz clic en el botón de aceptar. Se medirá el área de motilidad de cada colonia y se guardará un archivo CSV que contenga los datos en la carpeta designada. Para el ensayo de motilidad, autoclave una solución de agar que contiene M9, glucosa, ácidos casamino y sulfato de magnesio.

Vierte 25 mililitros del agar enfriado y mezclado en cada placa de Petri. Luego, inocula cada placa con 2,5 microlitros de cultivo bacteriano durante la noche e incuba a 37 grados Celsius durante 18 horas con las tapas hacia arriba para observar fenotipos de motilidad. Después de autoclavar una solución de LB con 1% de agar, vierte 25 mililitros de LB 1% agar mezclado y enfriado en placas de Petri.

Punza bacterias inoculadas en la parte inferior de las placas que contienen 1% de agar. Incuba las placas a 37 grados Celsius durante 48 horas, y luego a temperatura ambiente durante otras 48 horas. Tras la incubación, retira cuidadosamente el agar de las placas.

Visualiza la zona de espasmos teñiendo la placa de Petri con una solución de violeta cristalina al 1%. El ensayo de motilidad de espasmos mostró que los mutantes de Pseudomonas aeruginosa con deleciones génicas de la maquinaria T4P presentaban regiones de halo significativamente más pequeñas en comparación con el tipo salvaje, lo que indica una motilidad reducida de los espasmos. El análisis de motilidad por enjambre reveló que los mutantes de deleción de la biblioteca PA14 tenían regiones halo significativamente reducidas sin protuberancias, confirmando la capacidad defectuosa de enjambre.

Los estudios de motilidad bacteriana suelen estar limitados por su capacidad de producción. Nuestro protocolo de motilidad de alto rendimiento ayudará a los investigadores a estudiar la motilidad bacteriana de forma exhaustiva. Por ejemplo, utilizando una colección de mutantes a nivel genómico, es posible identificar todos los genes vinculados a la motilidad y revelar cómo las bacterias causan infecciones.

Nuestros hallazgos plantean nuevas preguntas sobre el control genético de la motilidad en Pseudomonas aeruginosa, su papel en la formación de biopelículas y su conexión con la patogénesis. También ayudan a explorar cómo las condiciones ambientales moldean los comportamientos de motilidad y si dirigirse a los genes de motilidad podría conducir a terapias antimicrobianas innovadoras.