Optimización de la administración de vesículas extracelulares mediante un andamio bioimpreso en 3D con vaina central para el tratamiento de heridas crónicas

El objetivo de la investigación es desarrollar un diseño avanzado de apósito bioactivo para heridas para un manejo eficaz de heridas crónicas. El andamio garantizará el control, la degradación y la entrega local eficiente de vesículas extracelulares.

El protocolo actual tiene como objetivo superar la limitación del apósito convencional para heridas en el manejo de la inflamación crónica. En particular, la falta de control, degradación y liberación oportuna de vesículas extracelulares.

Este protocolo ofrece un enfoque sintonizable para administrar agentes terapéuticos, incluidos genes, de manera oportuna para diversas aplicaciones.

Todos los resultados proporcionan nuevos conocimientos sobre la personalización de un andamio para varios tipos de heridas y la mejora de las terapias regenerativas mediante la carga de vesículas extracelulares con moléculas bioactivas específicas.

Nuestro laboratorio construirá una plataforma de investigación traslacional para abordar la cicatrización de heridas diabéticas.

[Narrador] Para comenzar, descongele rápidamente un vial de células madre mesenquimales en un baño de agua a 37 grados centígrados. Retire el vial cuando quede un pequeño fragmento de hielo. Transfiera todo el contenido del vial de células madre mesenquimales a un tubo cónico de 15 mililitros que contenga medio completo. Centrifugar las células a 200 G durante cinco minutos a temperatura ambiente. Aspire el sobrenadante y vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de medio completo precalentado. Luego transfiera las células a un matraz T25 que contenga cuatro mililitros de medio completo. Incline suavemente el matraz T25 para asegurarse de que las células se distribuyan uniformemente. Incube el matraz a 37 grados centígrados con un 5% de dióxido de carbono. Cuando las células hayan alcanzado una confluencia del 70% al 80%, aspire el medio gastado del matraz T25. Agregue tres mililitros de PBS fresco al matraz para eliminar las células residuales. A continuación, agregue un mililitro de solución de tripsina al 0,25% al matraz e incube. Monitoree el desprendimiento de células bajo el microscopio con un aumento de 4x. Ahora agregue cuatro mililitros de medio completo precalentado al matraz y pipetee hacia arriba y hacia abajo sobre la superficie hasta desprenderlo. Luego transfiera la suspensión celular a una centrífuga de 15 mililitros dos. Después de la centrifugación, vuelva a suspender el sedimento celular en un medio fresco y completo y cuente las células. Luego transfiera las células a un matraz T75 con una densidad de siembra de 5.000 células por centímetro cuadrado. Incube el matraz T75 a 37 grados centígrados con dióxido de carbono al 5%. Después de 72 horas, recolecte el medio acondicionado de las células para aislar vesículas extracelulares. Para aislar las vesículas extracelulares o EV, centrifugar los 13 mililitros de medios acondicionados recolectados a 800 G durante 15 minutos para eliminar los desechos celulares. Use un filtro de jeringa de 0.22 micrómetros para filtrar el sobrenadante y eliminar las partículas grandes. Ahora agregue cinco mililitros de tampón de precipitación al medio acondicionado filtrado. Agite la mezcla a fondo para asegurarse de que sea homogénea. Incube la mezcla durante la noche a cuatro grados centígrados para permitir que las vesículas extracelulares precipiten. Luego centrifugar la mezcla a 3.220 G durante 30 minutos a 20 grados centígrados. Asegurando que los tubos estén equilibrados. Deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el sedimento y centrifugue nuevamente durante cinco segundos. Ahora vuelve a suspender suavemente el pellet EV en 200 microlitros de PBS para evitar dañar las vesículas. Realice Western blot para detectar marcadores específicos de vesículas extracelulares, incluidos CD63, CD81 y CD9. Prepare una solución fresca de alginato de sodio al 4,5% en agua ultrapura estéril. Revuelva la solución durante la noche a 60 grados centígrados para asegurar una disolución completa. A continuación, disuelva la carboximetilcelulosa en agua ultrapura estéril para lograr una solución al 3,8%. Centrifugar las tintas biológicas preparadas a 3.220 G durante 10 minutos a 25 grados centígrados para eliminar las burbujas que puedan interferir en el proceso de impresión. Ahora use un mezclador de jeringa y mezcle tres mililitros de la solución de alginato de sodio preparada con EV etiquetados o el control Dialymmi. Mezclar bien suavemente para asegurar una suspensión uniforme. Use otro mezclador de jeringa para combinar un mililitro de carboximetilcelulosa con una solución de alginato liasa recién preparada en agua ultrapura estéril para lograr una concentración final de 0,5 miliunidades por mililitro. Cargue simultáneamente la tinta biológica EV de alginato de sodio en la parte central y la biotinta de alginato de carboximetilcelulosa liasa en la parte de la vaina de la configuración de la jeringa. Inicie el software de la impresora biológica 3D. Seleccione una forma cilíndrica con un patrón de relleno diagonal para crear la estructura del andamio. Ajuste el diámetro del cilindro a 20 milímetros y la altura a 1,1 milímetros. Configure el tamaño de poro a un milímetro. Ajuste las velocidades de bombeo de la boquilla del núcleo y la vaina a un milímetro por segundo con un espesor de 0,25 milímetros por capa. Configure la velocidad de movimiento a seis milímetros por segundo e imprima cuatro capas a temperatura ambiente. Use un humidificador con cloruro de calcio en aerosol para reticular el andamio durante el proceso de extrusión. Comience a imprimir el andamio en una película de poliéster. Coloque la boquilla del humidificador aproximadamente a 20 centímetros del cabezal de extrusión para garantizar una reticulación efectiva. Sumerja el andamio en una solución de cloruro de calcio al 2,2% durante 10 minutos para completar la reticulación. Enjuague el andamio tres veces con agua ultrapura estéril para eliminar el exceso de cloruro de calcio y tinta biológica no unida. Afeite la piel dorsal de un ratón diabético OCTA anestesiado con una maquinilla eléctrica evitando la irritación o lesiones de la piel. Ahora cree una herida cutánea circular de espesor completo de seis milímetros en la superficie dorsal de cada ratón. Coloque suavemente el andamio bioimpreso en 3D que contiene vesículas extracelulares marcadas con PKH sobre el lecho de la herida. Asegúrese de que el andamio cubra completamente la superficie de la herida y presione ligeramente con pinzas estériles para minimizar las bolsas de aire. Transfiera ratones anestesiados al sistema de imágenes IVIS a las dos horas, cuatro horas, ocho horas y 24 horas después del implante. En el asistente de imágenes, seleccione la opción de imágenes de fluorescencia y active los filtros de excitación y emisión para el colorante PKH. Ajuste la configuración de la cámara, incluido el campo de visión y la altura del sujeto para optimizar la detección de señales. Comience a adquirir imágenes, guarde los datos resultantes. Luego libere las señales fluorescentes de los vehículos eléctricos etiquetados. Los EV de alginato en el andamio de alginato de carboximetilcelulosa liasa exhibieron un perfil de liberación más rápido en comparación con los EV de alginato solo en carboximetilcelulosa, particularmente en los puntos de tiempo de dos y cuatro horas.