Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Nuestro grupo de investigación utiliza alcohol polivinílico, PVA y poliépsilon-caprolactona, PCL, membranas nanofibrosas para desarrollar un sistema de cocultivo en 3D. Su objetivo es responder cómo las membranas soportan las células epiteliales y fibroblásticas, imita los entornos tisulares y facilita el estudio de los patrones, las señales y las interacciones celulares. Demostraremos que las membranas nanofibrosas porosas electrohiladas permiten que las células epiteliales formen tejido epitelial, lo que permite que crezcan múltiples capas y fibroblastos en cada matriz adicional.

Los métodos ponen de manifiesto cómo un sistema 3D ampliado puede proporcionar tejidos en crecimiento con mejores entornos en comparación con los cultivos tradicionales en 2D. Ofrecemos un sistema de cocultivo que emplea células epiteliales diferenciadas. La organización con células madre requiere un procedimiento de diferenciación complejo, pero nuestro modelo tiene ventajas en simplicidad y ahorro de tiempo en el desarrollo de un sistema de cocultivo en 3D.

Nos centramos en superar la limitación de los andamios nanofibrosos mediante la combinación de membranas nanofibrosas con hidrogeles sobre capa en los cocultivos. Para empezar, añade 0,02 gramos de ácido poliacrílico y un gramo de PVA a una botella de vidrio limpia que contenga una barra magnética. Agregue 7,8 mililitros de agua destilada a la botella, luego coloque la botella en un agitador de platos.

Una vez que la botella se enfríe a temperatura ambiente, agréguele 0,2 mililitros de glutaraldehído y vuelva a colocarla en el agitador de placas a 500 RPM durante 30 minutos a temperatura ambiente. Use una jeringa de cinco mililitros para electro centrifugado. Separe los émbolos de los barriles y limpie los pequeños desechos de plástico dentro de los barriles y las puntas de los émbolos.

A continuación, use agujas para bloquear el flujo de líquido y vierta la solución de PVA en cada cilindro de la jeringa. Ensamble los émbolos en los barriles y retire las agujas. Después de ensamblar una nueva aguja de metal de calibre 27, colóquela en la máquina de electrohilar.

Envuelva bien el colector con papel de aluminio. Una vez que el panel del inyector vuelva a su posición original, configure la máquina de electrohilado a un volumen de inyección de dos mililitros, una tasa de inyección de seis microlitros por minuto, una velocidad del rodillo de 100 RPM y una distancia entre la punta y el colector de 14 centímetros. Verifique el flujo de líquido de cada bomba, luego haga funcionar la máquina de hilatura eléctrica con un potencial eléctrico de aproximadamente 12 kilovoltios.

Una vez completado el proceso de electrohilado, separe la lámina que contiene la estera de fibra del colector. Guarde el tapete de nanofibras en un desecante al vacío. Agregue 1,5 gramos de PCL y 8,5 mililitros de cloroformo a una botella de vidrio limpia.

Coloque el frasco en un agitador de placas y disuelva el PCL en cloroformo durante 12 horas a temperatura ambiente. Corte un pequeño trozo de la membrana de nanofibras, cubra las piezas con una fina capa de oro utilizando el proceso de pulverización automática durante cinco minutos. Para comenzar, corte la estera de nanofibras de PVA fabricada en pedazos del tamaño deseado para el inserto transwell.

Prepara un plato pequeño que contenga 1,5 mililitros de ácido clorhídrico puro. Coloque el plato con ácido clorhídrico y las piezas de nanofibra dentro de una cámara de vacío y cierre la tapa. Luego abra la válvula conectada a la bomba de vacío y espere 10 segundos hasta que suban los vapores de ácido clorhídrico.

Cierre la válvula y trate las membranas con vapores de ácido clorhídrico durante dos minutos. Después del tratamiento con ácido clorhídrico, agregue gotas de agua destilada a las membranas. Coloque las membranas en un portaobjetos de vidrio y retírelas del papel de aluminio.

Use un recubridor de pulverización catódica automática para cubrir las membranas con cinta de carbono con una capa delgada de oro. A continuación, lavar las nanomembranas de PVA reticuladas con ácido clorhídrico tres veces con PBS y sumergirlas en los medios de cultivo. Después del remojo, verifique el pH para confirmar la ausencia de ácido clorhídrico residual.

Para empezar, corte las esteras de nanofibras en trozos redondos con un diámetro de 10 milímetros para las nanomembranas de PVA y de 13 milímetros para las nanomembranas de PCL. Mezcle la base SYLGARD 184 y el agente de curado en una proporción de masa de 10 a uno en un vaso de plástico. Use un portaobjetos de vidrio limpio para mezclar vigorosamente la solución de polidimetilsiloxano, o PDMS, durante dos o tres minutos hasta que se formen burbujas.

Extienda el PDMS uniformemente en un portaobjetos de vidrio. Sumerja ligeramente el borde inferior del inserto en el PDMS. A continuación, coloque el inserto boca abajo en el calentador de portaobjetos durante 10 a 15 minutos hasta que el PDMS se endurezca.

Compruebe el PDMS con una punta de pipeta de 200 microlitros para asegurarse de que ya no esté pegajoso. Ahora, presione suavemente el pocillo del inserto sobre la pieza de nanomembrana de PVA, de modo que la parte inferior del pocillo del inserto mire hacia el lado de la nanofibra de la membrana. Agregue una gota de agua destilada al centro del pozo y use pinzas para quitar con cuidado el papel de aluminio.

A continuación, coloque el pocillo en una nueva placa de 24 pocillos y deje que la membrana se seque. Al colocar la pieza de nanomembrana, sumerja una punta de pipeta de 200 microlitros en la mezcla de PDMS y puntúrela con precisión en las cuatro esquinas y el centro del pocillo. Coloque la placa en el calentador de portaobjetos y deje que el PDMS se endurezca durante cinco a siete minutos.

A continuación, coloque la pieza de nanomembrana PCL en el pozo que contiene PDMS con el lado de la nanofibra unido al PDMS. Use un cepillo pequeño y limpio para presionar ligeramente el lado de aluminio de la membrana para una fijación completa. A continuación, añada 0,2 mililitros de etanol al 70% al pocillo para facilitar la retirada de la lámina.

Esterilice el inserto y el fondo bien en la configuración de transpocillos bajo luz ultravioleta durante la noche. Al día siguiente, lave el inserto y el pozo inferior agregando 200 microlitros de PBS al inserto y 500 microlitros al pocillo inferior durante tres ciclos de 10 minutos cada uno. Una vez que las células alcancen un 70 a 80% de confluencia, lávelas con 10 mililitros de PBS y agregue dos mililitros de tripsina EDTA al 0,05% para tripsinizarlas.

Golpee el plato suavemente para desalojar las células del fondo. Agregue ocho mililitros de medio de cultivo completo para neutralizar la enzima tripsina, luego transfiera la suspensión celular a un tubo de centrífuga de 50 mililitros. Centrifugar el tubo a 400 g durante cinco minutos.

Después de desechar el supranadante, vuelva a suspender el pellet de celda en cinco mililitros de DMEM completo con medio F12. A continuación, llene el pocillo inferior con 500 microlitros de medios DMEM F12 completos. Transfiera el inserto adjunto a la membrana nanofibrosa de PVA al transpozo y agregue 50 microlitros de suspensión celular MLE-12.

A continuación, llene el pocillo inferior de la membrana nanofibrosa PCL adherida con 500 microlitros de suspensión celular NIH3T3. Después de incubar las células durante dos horas, ensamble el inserto que contiene la célula MLE-12 y la célula NIH3T3 que contiene el pozo inferior en la configuración transwell, La distribución espacial de las células NIH3T3 y las células MLE-12 en el sistema de cocultivo se distinguió claramente, con células NIH3T3 verdes dispersas a diferentes profundidades y células MLE-12 rojas formando capas. Las células NIH3T3 infiltran la membrana nanofibrosa PCL y se extienden a lo largo de los ejes de las nanofibras, mientras que las células MLE-12 se adhieren a la superficie de la membrana nanofibrosa PDA y exhiben una agregación.