Name: Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2024-12-27T15:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 8 s
Description: Aprende a establecer un sistema de cocultivo tridimensional de células epiteliales y fibroblastos utilizando membranas nanofibrosas de PVA y PCL. Este método mejora el crecimiento celular y facilita el estudio de interacciones tisulares en ingeniería de tejidos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Sistema avanzado de cocultivo 3D de dos capas para células epiteliales y fibroblastos

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</ol>

<table><tbody><tr><td>0.05% Tripsina/EDTA</td><td>Welgene</td><td>LS015-01</td><td></td></tr><tr><td>100x Penicilina/Estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>20x PBS</td><td>LPS solución</td><td>CBP007A</td><td></td></tr> 4<tr><td>% Paraformaldehído</td><td>Biosesang</td><td>PC2031-050-00</td><td></td></tr><tr><td>Alexa Fluor-594 anticuerpo conjugado ZO-1</td><td>Invitrogen</td><td>339194</td><td></td></tr><tr><td>Diluyente de anticuerpos OP Quanto</td><td>Epredia</td><td>10129-576</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo CCK-8</td><td>Donginbio</td><td>CCK-3000</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultivo celular (150x20)</td><td>SPL</td><td>20151</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Verde CMFDA</td><td>Invitrogen</td><td>C7025</td><td></td></tr><tr><td>CellTracker Rojo CMTPX</td><td>Invitrogen</td><td>C34552</td><td></td></tr><tr><td>Cloroformo</td><td>Samchun</td><td>C0584</td><td></td></tr><tr><td>Tubo cónico</td><td>SPL</td><td>50050</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos</td><td>Corning</td><td>CLS2980245</td><td></td></tr><tr><td>DMEM alta glucosa</td><td>Welgene</td><td>LM001-05</td><td></td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Welgene</td><td>LM 002-05</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Bases de desecador con brida plana, rosca de tornillo</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td>7.022 260</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Tapa y desecador de vidrio Llave de paso</td><td>Daihan Science</td><td>SM.2444061</td><td></td></tr><tr><td>DURAN Llave de paso, con husillo de PTFE</td><td>DWK Life Sciences&nbsp;</td><td></td><td></td>10322671</tr><tr><td>Máquina de electrohilado</td><td>NanoNC ESR200RD</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico,</td><td>Pure Sigma Aldrich 459844</td><td></td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TMS-013-BKR&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Módulo de escáner confocal láser de fluorescencia K1-fluo</td><td>Sistemas</td><td></td><td></td>de nanoscopio</tr><tr><td>Gel / montaje</td><td>Biomeda&nbsp;Corp.</td><td>M01</td><td></td></tr><tr><td>Solución de glutaraldehído</td><td>Sigma Aldrich</td><td>340855</td><td></td></tr><tr><td>Hoechst 33342</td><td>Invitrogen</td><td>H1399</td><td></td></tr><tr><td>Boquilla metálica 27G</td><td>NanoNC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Esmalte de uñas</td><td>Nature republic</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Suero de cabra normal</td><td>Vector Laboratories</td><td>S-1000</td><td></td></tr><tr><td>Tetróxido de osmio</td><td>Sigma Aldrich</td><td>201030</td><td></td></tr><tr><td>Phalloidin-iFlour 488</td><td>abcam</td><td>ab176753</td><td></td></tr><tr><td>Cerradura de Syringe_Lure de plástico (10 mL)</td><td>HENKE SASS WOLF</td><td>AL10</td><td></td></tr><tr><td>Poli(ácido acrílico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>323667</td><td></td></tr><tr><td>Poli(alcohol vinílico)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>341584</td><td></td></tr><tr><td>Policaprolactona</td><td>Sigma Aldrich</td><td>440744</td><td></td></tr><tr><td>Pure HCL</td><td>Duksan</td><td>1129</td><td></td></tr><tr><td>Microscopía electrónica de barrido</td><td>SEC</td><td>SNE-4500M</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de vidrio</td><td>Marienfeld Superior</td><td>K15663717</td><td></td></tr><tr><td>Sylgard 184 set</td><td>omniscience</td><td>OMNI.05255</td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 Lector multimodo</td><td>Biotek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma Aldrich</td><td>X100</td><td></td></tr></tbody></table>

establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Establishing a Three-Dimensional Coculture Module of Epithelial Cells Using Nanofibrous Membranes

Este protocolo describe los pasos críticos para la coculturión de células epiteliales pulmonares MLE-12 y fibroblastos NIH3T3 mediante la construcción de un modelo de dos capas basado en membrana nanofibrosa (Figura 1). Este modelo se adapta a la obtención de imágenes de células vivas, la inmunohistoquímica y el análisis cuantitativo de puntos finales de células cocultivadas. También se pueden utilizar otros tipos de células optimizando la densidad celular y las condiciones de crecimiento.
SEM muestra la distribución uniforme de las nanofibras de PVA fabricadas sin ninguna formación de cordones (Figura 2A). El diámetro de las nanofibras de PVA osciló entre 150 nm y 230 nm (180 ± 25 nm, media ± desviación estándar (DE)). Las nanofibras en las NM de PCL electrohiladas estaban orientadas aleatoriamente y estructuralmente se parecían al colágeno (Figura 2B). La mayoría de las fibras de los NM PCL tenían un diámetro de entre 300 nm y 7 μm (3,8 ± 2,5 μm). Por lo tanto, la membrana nanofibrosa de PVA tenía tamaños de poro más pequeños que la membrana nanofibrosa de PCL.
Antes de la siembra, las células MLE-12 y NIH3T3 se tiñeron con Cell-Tracker rojo y verde, respectivamente, y se monitorizaron durante todo el proceso de cocultivo. Como se muestra en la Figura 3, se pudo observar claramente la distribución espacial de las células MLE-12 en la cámara de inserción y de las células NIH3T3 en la cámara inferior. El análisis de apilamiento de focos reveló que las células NIH3T3 se dispersaron y detectaron a diferentes profundidades (102 ± 20 μm), mientras que las células MLE-12 formaron capas con un espesor de 80 ± 10 μm. Las células NIH3T3 se infiltran en la membrana nanofibrosa de PCL y se extienden a lo largo de los ejes de las nanofibras, mientras que las células MLE-12 se adhieren a la superficie de la membrana nanofibrosa de PVA y exhiben una agregación (Figura 4). A continuación, examinamos la organización del citoesqueleto de las células NIH3T3 y las células MLE-12 mediante tinción de actina. Las células NIH3T3 cultivadas en membrana nanofibrosa PCL muestran una distribución proyectil de filamentos de actina que se asemejan a las células en el tejido, y la tinción de actina en células MLE-12 cultivadas en membrana nanofibrosa de PVA muestra agregados redondos sin propagación celular (Figura 5).
Se comparó la distribución y el patrón de crecimiento de las células MLE-12 en monocultivo y cocultivo. Las células teñidas de rojo con Cell-Tracker en monocultivo en los NM de PVA formaron agregados, pero las células en condición de cocultivo mantuvieron una distribución uniforme en la membrana (Figura 6A). En un análisis 3D de imágenes de microscopía confocal, el patrón de crecimiento de las células MLE-12 cocultivadas en los NM de PVA muestra una adhesión en capas de las células cultivadas a la membrana con una mayor densidad celular confluente, en comparación con las células cultivadas en ausencia de fibroblastos (Figura 6B). Además, la adhesión célula a célula y la expresión de ocludina zonal (ZO)-1 en las superficies celulares (flecha indicada), pero no de los agregados celulares, fueron más evidentes en la condición de cocultivo que en el cultivo sin fibroblastos (Figura 6C).
La proliferación de células en las membranas se midió mediante el ensayo CCK-8. La proliferación de células NIH3T3 y MLE-12 aumentó con el tiempo (Figura 7). Sin embargo, se observaron tasas de crecimiento más bajas de las células en las membranas que en una placa de cultivo (datos no mostrados). Las células NIH3T3 y MLE-12 cocultivadas en NM muestran una tasa de crecimiento estable en comparación con las células monocultivadas en una placa de cultivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema para ilustrar el método de cocultivo de fibroblastos NIH3T3 y células epiteliales MLE-12 en el sistema de dos capas basado en andamios. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig02.jpg"> 
Figura 2: Estructura de las nanofibras de PVA y PCL. Las membranas nanofibrosas de (A) PVA y (B) PCL se produjeron mediante electrohilado. La estructura y el diámetro de las nanofibras se miden mediante SEM de las superficies de las membranas. Barras de escala = 1 μm (A), 10 μm (B). Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig03.jpg"> 
Figura 3: En un sistema de cocultivo, la distribución espacial de las células NIH3T3 en la membrana nanofibrosa PCL y las células MLE-12 en la membrana nanofibrosa PVA. Las células NIH3T3 (4 × 105) se tiñeron con Cell-Tracker Green, y las células MLE-12 (3 × 105) se tiñeron con Cell-Tracker Red. Las células sembradas se cultivaron durante 24 h y se observaron utilizando una imagen de apilamiento en Z de un microscopio confocal. Los números se indican en μm; Las flechas muestran las dimensiones con x (ancho), y (largo), z (profundidad). Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig04.jpg"> 
Figura 4: Adhesión y morfología de las células NIH3T3 en la membrana nanofibrosa PCL y de las células MLE-12 en la membrana nanofibrosa PVA. Las células se cultivaron en las membranas durante 24 h y se observaron mediante SEM con un aumento de 2.000x. Barras de escala = 15 μm. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig05.jpg"> 
Figura 5: Fibras de estrés de actina en células NIH3T3 en la membrana nanofibrosa PCL y células MLE-12 en membrana nanofibrosa PVA. Las células NIH3T3 (4 × 105) y las células MLE-12 (3 × 105 células) se sembraron en las membranas nanofibrosas de PCL y PVA, respectivamente. Después de 48 h de cultivo, las células se tiñeron con faloidina-iFlour 488 y se observaron mediante microscopía confocal. Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico; PCL = poli(ε-caprolactona); FITC = isotiocianato de fluoresceína. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig06.jpg"> 
Figura 6: Patrón de crecimiento de células MLE-12 cocultivadas en membrana nanofibrosa de PVA. (A) Las células MLE-12 teñidas en rojo con Cell-Tracker (3 × 105 células) se sembraron en la membrana nanofibrosa de PVA y se cultivaron solas (células -NIH3T3) y con células NIH3T3 en un sistema de dos capas (células +NIH3T3) durante 48 h. (B) Las células MLE-12 monocultivadas y cocultivadas durante 48 h se tiñeron con Hoechst 33342 (azul) y Phalloidin-iFlour 488 y se observaron utilizando un microscopio confocal. Las imágenes 3D se muestran utilizando la función de superficie del software Imaris. (C) Las células MLE-12 se cultivaron durante 48 h y se marcaron con fluorescencia con Phalloidin-iFlour 488 y anticuerpo anti-ZO-1 (rojo). Barras de escala = 50 μm. Abreviaturas: PVA = alcohol polivinílico. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67780/67780fig07.jpg"> 
Figura 7: Tasa de crecimiento de las células en un sistema de cocultivo de dos capas. Las células NIH3T3 (4, ×, 10,5) y las células MLE-12 (3, ×, 10,5) se cocultivan durante el tiempo indicado. El crecimiento celular en el inserto y el pocillo inferior se mide mediante el ensayo CCK-8. Los datos se presentan como media ± DE (n = 3). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67780/67780fig07large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Establecimiento de un módulo de cocultivo tridimensional de células epiteliales utilizando membranas nanofibrosas

Technical hurdles in a culture of epithelial cells include dedifferentiation and loss of function. Biomimetic three-dimensional (3D) cell culture methods ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un método simple se describe para analizar los efectos de los fibroblastos del tejido en las células epiteliales asociados. La combinación de este método y tridimensional cultivo de tejidos puede facilitar el análisis de las células después del aislamiento de 3D. La técnica es aplicable a las células de diferentes potencial maligno, permitiendo el estudio sistemático de los efectos de estroma asociado al tumor en las células tumorales.

Aislamiento de células epiteliales mamarias de tridimensional mixto de células Esferoide Co-cultura

Los avances en las tecnologías de biomateriales permiten el desarrollo de construcciones tridimensionales de tipo multicélula. Hemos desarrollado protocolos de electrospinning para producir tres andamios individuales para cultivar las principales células estructurales de la vía aérea y proporcionar un modelo 3D in vitro de la pared del bronquiolo de la vía aérea.

Adaptación del Proceso Electrohilado para proporcionar tres ambientes únicos para un Tri-capa<em&gt; In Vitro</em&gt; Modelo de la pared de la vía aérea

Este manuscrito describe una técnica basada en litografía suave para diseñar matrices uniformes de tres dimensiones (3D) los tejidos epiteliales de la geometría definida rodeadas por matriz extracelular. Este método es susceptible de una amplia variedad de tipos de células y contextos experimentales y permite la selección de alto rendimiento de repeticiones idénticas.

Ingeniería tridimensionales epiteliales tejidos embebidos dentro de la matriz extracelular

Modelos de cultura bicapa actuales no permiten estudios funcionales en vitro que imitan en vivo microambientes. Uso de glicol de polietileno y un método de plantillas de óxido de zinc, este protocolo describe el desarrollo de una membrana del sótano biomiméticos ultrafino con rigidez sintonizable, porosidad y composición bioquímica que imita muy de cerca en vivo matrices extracelulares.

Hidrogeles ultrafino Porated elástico como una membrana del sótano biomiméticos para doble cultura de la célula

Aquí, presentamos un protocolo para obtener sistemas 3D-cultura en uno mismo-montaje de andamios péptido para promover la diferenciación de condrocitos articulares humanos dedifferentiated en tejido similar al cartílago.

Cultivo de células de mamífero en andamios tridimensionales péptido

Este protocolo describe el aislamiento de células epiteliales de diferentes regiones anatómicas de la membrana amniótica humana para determinar su heterogeneidad y propiedades funcionales para su posible aplicación en modelos clínicos y fisiopatológicos.

Cultivo In Vitro de Células Epiteliales de Diferentes Regiones Anatómicas de la Membrana Amniótica Humana

El protocolo presentado describe el desarrollo y uso de una técnica de tinción de actina filamentosa basada en faloidina con microscopía de barrido láser confocal (CLSM) para visualizar la estructura de la capa celular adherente en canales de cultivo dinámico microfluídico y cámaras tradicionales de cultivo estático de pozo fijo. Este enfoque ayuda a evaluar la confluencia de la capa celular, la formación de monocapa y la uniformidad del espesor de la capa.

Preparación y evaluación estructural de monocapas de células epiteliales en un dispositivo de cultivo microfluídico de tamaño fisiológico

Los insertos de cultivo de tejidos con membranas de plástico son el estándar de oro en los laboratorios de cultivo celular como soportes permeables para establecer capas celulares y modelos de tejidos de barrera. En este artículo, presentamos un método simple para reemplazar la membrana de plástico con una membrana biológicamente más relevante hecha de una proteína de seda de araña funcionalizada recombinante.

Membrana basal nanofibrilar imitadora hecha de seda de araña funcionalizada recombinante en insertos de cultivo de tejidos hechos a medida

Un protocolo de sellado novedoso para producir sellos herméticos a base de silicona para membranas de dispositivos de chip de polidimetilsiloxano (PDMS). Destinado a laboratorios, montaje de modelos de chips y desarrollo de plataformas de chips a pequeña escala. Demostramos el protocolo utilizando membranas plásticas y tisulares nativas. Este procedimiento solo requiere PDMS, tolueno, moho, membrana y una cámara de vacío.

Procedimiento accesible de sellado de silicona chip-membrana para una unión flexible y fiable

Resolución óptica de microscopía fotoacústica (O-PAM) es una tecnología emergente capaz de absorción de imágenes ópticas...

Tridimensional óptico resolución microscopía fotoacústica

Aprende a establecer un sistema de cocultivo tridimensional de células epiteliales y fibroblastos utilizando membranas nanofibrosas de PVA y PCL. Este método mejora el crecimiento celular y facilita el estudio de interacciones tisulares en ingeniería de tejidos.

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