Name: Extracción del módulo de Young de las membranas basales pulmonares murinos nativas de los mapas de fuerza derivados de la microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 55 s
Description: Aprenda a extraer el módulo de Young de membranas basales pulmonares murinas mediante microscopía de fuerza atómica y análisis de datos en MATLAB. Este método preserva las propiedades mecánicas de muestras biológicas nativas.

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<table><tbody><tr><td>Jeringa de 1 mL</td><td>B Braun</td><td>9166017V</td><td>Injekt-F</td></tr><tr><td>Jeringa de 10 mL</td><td>B Braun</td><td>4606108V</td><td>Injekt Luer Solo</td></tr><tr><td>15 mL Tubo Falcon</td><td>Sarstedt</td><td>62.554.002</td><td>tubo con tapón de rosca</td></tr><tr><td>Voladizo - MLCT</td><td>Sondas Bruker AFM</td><td>3444</td><td>AFM en voladizo con forma de punta piramidal</td></tr><tr><td>Cuchillas de criotomo</td><td>Leica Biosystems 14035843496</td><td></td><td>Cuchillas desechables de perfil bajo DB80LX</td></tr><tr><td>Soporte de muestras de criotomo</td><td>14047740044</td><td>Disco de muestras</td><td>Leica Biosystems</td> 30</tr><tr><td>Cyotome</td><td>Leica Biosystems</td><td>CM1950</td><td>Leica Cryostat</td></tr><tr><td>Direct Overlay Extension Bruker</td><td></td><td></td><td>Software extensión para el software JPK SPM que permite importar la imagen óptica del microscopio invertido en el visor de datos del software SPM.</td></tr><tr><td>Molde base desechable</td><td>Science Services</td><td>SA62534-15</td><td>Tissue-Tek Cryomold 15x15x5 mm</td></tr><tr><td>Cinta de doble cara</td><td>tesa Film</td><td>56661-00002</td><td>Cinta de película fotográfica</td></tr><tr><td>Soporte en voladizo de resorte fijo</td><td>Microscopio</td> invertido Bruker <td></td><td></td></tr><tr><td>- Leica DMi8</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK Escenario Motorizado</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK NanoWizard 4XP BioScience</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>JPK SPM Software</td><td>Bruker</td><td></td><td></td></tr><tr><td>K5 Microscopio CMOS Kamera</td><td>Leica Microsystems</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB</td><td>Mathworks</td><td></td><td>versión R2024a o superior</td></tr><tr><td>MATLAB - Curve Fitting Toolbox&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Caja de herramientas de procesamiento de imágenes</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Caja de herramientas de procesamiento de señales&nbsp;</td><td>Mathworks</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MATLAB - Caja de herramientas de estadística y aprendizaje automático</td><td>Portaobjetos</td> de microscopio Mathworks <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Carl Roth</td><td>H869.1</td><td>Portaobjetos de microscopio lisos para calibración en voladizo</td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio - borde esmerilado</td><td>Carl Roth</td><td>H870.1</td><td>Portaobjetos de microscopio con borde esmerilado para crioseccionado</td></tr><tr><td>Aguja y barra diagonal; 0,9 mm y veces; 25 mm</td><td>B Braun</td><td>4657500</td><td>OCT inyección &nbsp; en la muestra de pulmón</td></tr><tr><td>Aguja y oslash; 0,9 mm y veces; 70 mm</td><td>B Braun 4665791</td><td></td><td>Aguja larga para aplicar PBS bajo el</td></tr><tr><td>compuesto AFM OCT</td><td>Sakura Finetek</td><td>4583</td><td>Tissue-Tek O.C.T. Compuesto</td></tr><tr><td>Fosfato Salino tamponado</td><td>Bio& Venda</td> la solución <td>BS.L1825</td><td>PBS sin Ca2+, Mg2+, 500 mL</td></tr><tr><td>QI Advanced Imaging Extension</td><td>Bruker</td><td></td><td>Software extension para el software JPK SPM que proporciona para cada píxel de imagen grabada toda la curva de fuerza subyacente.</td></tr><tr><td>Bisturí</td><td>B Braun 5518083</td> Tijeras quirúrgicas <td></td><td>desechables para bisturí</td></tr><tr><td>Kaut-Bullinger M681700</td><td></td><td>Precise Scissors 13 cm&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de una cara</td><td>tesa Film</td><td>57330-00000</td><td>cinta transparente, 33 m x 19 mm</td></tr><tr><td>Caja de portaobjetos</td><td>GWL Storage Systems</td><td>K50W</td><td>Caja deslizante para 50 portaobjetos</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico - Stemi DR1663</td><td>Pinzas Zeiss</td><td></td><td></td></tr><tr><td>- Vomm SS-SA-ESD</td><td>Eleshop</td><td>ELE002121</td><td></td></tr></tbody></table>

extracción del módulo de young de las membranas basales pulmonares murinos nativas de los mapas de fuerza derivados de la microscopía de fuerza atómica

Extracting the Young's Modulus of Native Murine Pulmonary Basement Membranes from Atomic Force Microscopy Derived Force Maps

Después de la identificación y medición de una pared alveolar intacta, el resultado primario de este protocolo son los valores filtrados del módulo de Young de la MO. Es importante tener en cuenta que no es posible encontrar una pared alveolar adecuada para la medición de la MFA en todas las secciones de tejido. En nuestras observaciones experimentales, aproximadamente el 75% de las criosecciones derivadas de especímenes de pulmón murino exhibieron una pared alveolar cuantificable. Para determinar con precisión la distribución espacial del módulo de Young en un BM pulmonar, aconsejamos emplear mapas de fuerza que abarquen 3 μm x 3 μm o 4 μm x 4 μm. Este enfoque garantiza una resolución suficiente para examinar los BM pulmonares de ratón, que suelen medir entre 100 y 200 nm de grosor. Por lo tanto, el enfoque experimental consiste en capturar curvas de fuerza de 50 x 50 para cada mapa de fuerzas, lo que produce un total de 2.500 curvas de fuerza. Dentro del mapa de fuerzas, las curvas de fuerzas están espaciadas uniformemente. Esto implica que, además del módulo de Young de la BM, las estructuras tisulares que rodean la BM se sondean incluso en los mapas de fuerza pequeños. Por lo tanto, para determinar de manera precisa y selectiva el módulo de Young exclusivamente de la MO pulmonar, implementamos un proceso de filtrado de dos pasos en este protocolo.
El paso de filtrado inicial del filtrado espacial dependiente del operador selecciona los resultados de ajuste de la curva de fuerza que se originan en el MO pulmonar murino, que comprende aproximadamente el 10% al 25% de los valores totales de los resultados contenidos en el mapa de fuerza analizado. Después de este filtrado espacial inicial, se conservan aproximadamente entre 250 y 625 resultados de ajuste para su posterior análisis. El siguiente paso de filtrado garantiza que solo se incluyan los resultados relacionados con BM que se originan en las curvas de fuerza adecuadamente descritas por el modelo de Hertz modificado. Por lo tanto, se utiliza como criterio de filtro el coeficiente de determinación (R2) del ajuste del modelo de Hertz modificado. Nuestra experiencia empírica sugiere que mantener resultados con valores de R2 superiores a 0,96 es adecuado para obtener resultados de ajuste mediante la adherencia a este protocolo. Es importante tener en cuenta que el valor de R2 está significativamente influenciado por la calidad (suavidad) y la longitud de la línea base de la curva de fuerzas, la determinación del punto de contacto y la convergencia del modelo ajustado. Después de la aplicación de ambos procedimientos de filtrado, generalmente quedan aproximadamente de 100 a 500 valores del módulo de Young para la MO de una sola pared alveolar.
La distribución de estos valores restantes del módulo de Young desde el BM se puede visualizar utilizando un histograma (Figura 4A). Es importante señalar que los valores del módulo de Young resultantes de la MO pulmonar siguen una distribución logarítmica normal, que se observa comúnmente para variables aleatorias que solo pueden alcanzar valores positivos61. Esto se visualiza mediante el gráfico QQ de la Figura 4B. En consecuencia, se puede ajustar una distribución normal (gaussiana) a la distribución de los valores del módulo de Young (E) transformado logarítmicamente. Aquí, se utilizó el logaritmo natural (ln) para transformar los valores E . De este ajuste se extrajeron la posición máxima de la distribución (μ) y la desviación estándar (σ) y posteriormente se retransformaron para obtener el módulo de Young representativo, denotado como EBM, utilizando la siguiente ecuación:
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq01.jpg" style="margin: auto;">
Tenga en cuenta que después de la retransformación, el intervalo de desviación estándar ya no es simétrico alrededor del valor máximo. Los bordes negativos (σ-) y positivos (σ+) del intervalo de desviación estándar se pueden calcular mediante las siguientes expresiones:
<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq02.jpg" style="margin: auto;">
<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67784/67784eq03.jpg" style="margin: auto;">
Estas ecuaciones son consecuencia del hecho de que la función exponencial es la función inversa del logaritmo neperiano62.
Después de retransformar el valor máximo μ = 9,31 y la desviación estándar σ = 0,18 determinada a partir del histograma de la Figura 4A, el valor representativo del módulo de Young es EBM = 11,05 kPa con un intervalo de desviación estándar de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. Alternativamente, se puede ajustar una distribución log-normal al histograma de los valores del módulo de Young (E) no transformados para determinar los parámetros característicos de la distribución.
Se recomienda analizar al menos cuatro paredes por ratón para obtener un resultado representativo robusto como hemos demostrado en detalle en Hartmann et al.59. Para determinar el módulo de Young representativo EBM para un ratón, los valores transformados logarítmicamente de las cuatro paredes se trazaron en un histograma combinado y μ y σ se determinaron ajustando una distribución normal. Posteriormente, μ y σ se vuelven a transformar como se describió anteriormente para recuperar EBM y el intervalo de desviación estándar para el ratón en cuestión.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig01.jpg"> 
Figura 1: Resumen de los principales pasos del protocolo para determinar el módulo de Young de una membrana basal pulmonar murina. El paso inicial consiste en obtener y preparar pulmones murinos, seguidos de su incrustación. Por lo tanto, el pulmón se inyecta con una combinación de medio OCT y PBS, y luego se sumerge completamente en el compuesto OCT. Posteriormente, se obtienen secciones de tejido pulmonar de 15 μm de espesor mediante criosección con un criótomo. En este protocolo, detallamos el proceso de empleo de cintas adhesivas de una y dos caras para asegurar las muestras en su lugar durante el proceso de corte. Posteriormente, los valores del módulo de Young de la BM se determinan a través de mediciones del mapa de fuerza de AFM en las secciones de tejido. Una vez finalizado el proceso de análisis de la curva de fuerzas, se aplica un filtrado espacial y R² para aislar los resultados del módulo de Young de la estructura de interés, específicamente el BM (mostrado en verde en el mapa de fuerzas y cuantificado en la distribución del módulo de Young transformado logarítmicamente). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig02.jpg"> 
Figura 2: Un ejemplo de experimento de AFM con mapa de fuerza realizado en una sección de tejido pulmonar murino. (A) Imagen general de microscopía de campo claro de una sección de tejido pulmonar murino, que permite la identificación de paredes alveolares intactas adecuadas situadas entre dos alvéolos. En el lado derecho de la imagen, se puede ver el voladizo MLCT F de forma triangular del AFM. (B) Vista ampliada de una pared seleccionada dentro de la sección de tejido. (C) Canal de pendiente y (D) altura de un mapa general de 15 x 15 μm que contiene curvas de fuerza de 50 x 50 de la pared alveolar. En el canal de pendiente, el BM se puede identificar como una línea brillante (flecha blanca), lo que indica una estructura de mayor rigidez dentro del muro. El canal de altura confirma la integridad del muro, sin mostrar evidencia de ruptura. Después de la identificación del BM en el mapa general de 15 x 15 μm, se registra un mapa más pequeño de 4 x 4 μm (E: canal de pendiente, F: canal de altura) con curvas de fuerza de 50 x 50. Barras de escala: (A) 200 μm y (B-D) 25 μm. Los rangos de las escalas de color de las imágenes AFM mostradas son (C) 2,36 - 9,29 nN/μm, (D) 0 - 3,38 μm, (E) 2,36 - 9,29 nN/μm (imagen general) y 2,42 - 8,37 nN/μm (imagen más pequeña), (F) 0 - 3,38 μm (imagen general) y 0 - 1,99 μm (imagen más pequeña), de oscuro a brillante. Se utilizaron escalas de color lineales para todas las imágenes AFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig03.jpg"> 
Figura 3: Visualización del procedimiento de filtrado espacial. (A) El mapa de módulo de Young resultante del análisis de la curva de fuerzas, tal como se muestra en la herramienta de filtrado de resultados para permitir el filtrado espacial de los resultados. El BM es identificable como una franja brillante (valores altos del módulo de Young) rodeada de compartimentos de tejido más blandos. (B) Histograma de los valores del módulo de Young correspondientes al mapa sin filtrar (A). Después de la (C) aplicación de la máscara de filtro espacial (área verde), (D) el histograma comprende exclusivamente los valores del módulo de Young de la región resaltada en verde, que se identificó como BM. Tenga en cuenta que los valores suaves residuales observables en el lado izquierdo del histograma se pueden atribuir a ajustes poco convergentes, que se eliminarán en el siguiente paso de filtrado de R². <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67784/67784fig04.jpg"> 
Figura 4: Distribución del módulo de Young de una MO pulmonar murina recibida siguiendo este protocolo. (A) Histograma logarítmico normalizado de los valores del módulo de Young de la MO resultante (N = 325). Ajustando una distribución normal (línea continua negra), se determina el valor medio μ = 9,31 con una desviación estándar de σ = 0,18. Después de la retransformación, esto corresponde a un módulo de Young del BM de EBM = 11,05 kPa con un intervalo de desviación estándar asimétrico de [-1,82 kPa, +2,18 kPa]. (B) QQ: Gráfica de los cuantiles de los valores del módulo de Young de BM logarittizados frente a los cuantiles de una distribución normal estándar. Este gráfico demuestra que, con la excepción de algunos valores en las colas izquierda y derecha de la distribución, los valores del módulo de Young resultantes se distribuyen principalmente log-normal. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67784/67784fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Extracción del módulo de Young de las membranas basales pulmonares murinos nativas de los mapas de fuerza derivados de la microscopía de fuerza atómica

Atomic force microscopy (AFM) allows the characterization of the mechanical properties of a sample with a spatial resolution of several tens of ...

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Extracción del módulo de Young de las membranas basales pulmonares murinos nativas de los mapas de fuerza derivados de la microscopía de fuerza atómica (Video) | JoVE Journal

Extracción del módulo de Young de las membranas basales pulmonares murinos nativas de los mapas de fuerza derivados de la microscopía de fuerza atómica

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