Aplicación de un nuevo hidrogel de hialuronano para el cultivo tridimensional de folículos y metodología para la criopreservación de folículos ováricos de ratón

Esta investigación se ha centrado en el desarrollo de un sistema de cultivo 3D para el crecimiento de folículos in vitro y la maduración de ovocitos. La creación de un sistema de este tipo utilizando componentes de la matriz extracelular nativa de una célula mejorará el desarrollo del folículo. El mayor desafío es aplicar el conocimiento de los modelos animales al cultivo de folículos humanos.

El acceso al tejido ovárico humano es limitado. Y los folículos humanos requieren un tiempo significativamente más largo en cultivo para lograr la maduración de los ovocitos. El modelo de cultivo 3D desarrollado en este estudio puede ser especialmente útil para el cultivo de folículos ováricos humanos, permitiendo la retención de la arquitectura 3D durante el tiempo prolongado necesario en el cultivo para la maduración de los ovocitos.

Para comenzar, obtenga ovarios de cachorros de ratón B6D2F1 de 10 a 14 días de edad para el procedimiento. Pipetee 6 mililitros de medio de cultivo de folículos preequilibrado, o FCM, en dos placas de 60 milímetros y cúbralas con aceite mineral, e incube. Pipetear 1 mililitro de colagenasa en el pocillo central del plato y 3 mililitros de tejido ovárico, o OT media, en el pocillo exterior.

Mueva los ovarios a la solución de colagenasa. Al final de la incubación de la colagenasa, mueva los ovarios tratados con colagenasa al pozo externo para enjuagar. Cambie las micropipetas y transfiera los ovarios a un plato nuevo lleno de medio OT.

Para recolectar los folículos, aspire y expulse repetidamente el tejido ovárico tratado con enzimas a través de puntas de pipeta cortadas a diferentes tamaños. Excave mecánicamente el tejido con agujas de calibre 27 para liberar ocho folículos. Examine bajo un microscopio de disección con un aumento de 40x y recoja folículos preantrales secundarios con un ovocito ubicado en el centro encerrado dentro de una membrana basal intacta en una placa OT fresca.

Coloque el plato FCM2 en la incubadora durante 60 minutos antes de comenzar el proceso de inclusión. Haga dos gotas de 25 microlitros de gel de HA sin peróxido de hidrógeno en la tapa para enjuagar. Mueva los folículos o grupos de folículos que se van a incrustar desde la placa FCM a una gota de hialuronano, o gel de HA, para enjuagar sin medio de cultivo.

Vuelva a colocar el plato FCM debajo del burbujeador para gas. Para incrustar folículos, coloque 1 microlitro de peróxido de hidrógeno al 0,03% en la tapa de un plato de 60 milímetros. Ahora, agregue 25 microlitros de 3 miligramos por mililitro de gel HA y mezcle.

Pipetee aproximadamente de ocho a 10 microlitros de la mezcla de peróxido de hidrógeno HA en dos pocillos separados de la placa de cultivo de ocho pocillos. Y transfiera rápidamente los folículos, grupos de folículos o fragmentos de tejido ovárico al centro de cada gota. Asegúrese de que no haya burbujas dentro de la gota.

Después de tres minutos, agregue 100 microlitros de medio de cultivo de folículos preequilibrado a cada pocillo. Cubra con aceite mineral preequilibrado tibio e incube el plato. Preparar el equipo y las soluciones necesarias para el proceso de vitrificación.

Coloque el portador RI en la ranura de la caja criogénica que contiene nitrógeno líquido. Coloque dos gotas de solución de vitrificación precalentada 1, o VS1, una al lado de la otra en la tapa de un plato de 60 milímetros cerca de la parte superior. Ahora, coloque dos folículos en la primera gota, enjuague y muévalos rápidamente a la segunda gota de VS1 para una incubación de cinco minutos.

Mientras los folículos se incuban, haga tres gotas de VS2 justo debajo de las gotas de VS1. Luego, mueva rápidamente los folículos secuencialmente a través de las tres gotas de VS2 en 60 segundos. Para la vitrificación, recoja los folículos de VS2.

Vea el transportista de instancias reservadas en el ámbito de disección. Y ajusta el enfoque para visualizar el pequeño agujero en el palo de plástico. Deposite los folículos con un mínimo de líquido en el orificio.

Deje caer el palito de plástico en la pajita exterior preenfriada. Y use un sellador ultrasónico para cerrar la pajita. Coloque la pajita en una copa unida a la caña criogénica.

Cubra la caña con una funda protectora de plástico y sumérjala en nitrógeno líquido. Para la vitrificación de portador abierto, prepare el portador insertando el vástago de CL de metal en la tapa del vial magnetizado, asegurando una sujeción firme. Coloque una rejilla en la caja criogénica para contener los viales criogénicos, asegurándose de que el nitrógeno líquido esté debajo de la parte superior de los viales.

Llene un vial criogénico inventado magnetizado con nitrógeno líquido y colóquelo en la gradilla. Sujete el soporte abierto CL por su tapa magnética adjunta con una varilla magnética. Sumerja el portador de CL en una gota separada de VS2 para crear una película crioprotectora.

Recoja todos los folículos o grupos de folículos y colóquelos en la película con un mínimo de líquido. Sumerja inmediatamente el CL en el vial criogénico lleno de nitrógeno líquido para vitificar la muestra. Coloque el vial criogénico en el bastón criogénico y luego cúbralo con una funda de plástico.

Sumerja la caña en un tanque de almacenamiento de nitrógeno líquido. Prepare un plato de pocillo central con 3 mililitros de FCM preequilibrado en el pocillo exterior y 1 mililitro en el pocillo central. Después de cubrir el medio con aceite, coloque el plato debajo del burbujeador para gas.

Coloque 0,5 mililitros de soluciones de calentamiento WS1 y WS2 preequilibradas a 37 grados Celsius en dos platos de pocillos centrales etiquetados. Mueva los bastones criogénicos con muestras del tanque de almacenamiento a una caja criogénica llena de nitrógeno líquido. Primero, retire la cubierta de plástico del bastón.

Luego, manteniendo la pajita sumergida, retírela de la copa y deslícela en la ranura de sujeción de la caja criogénica. Corta la pajita exterior justo por encima del punto negro. Levante el palito de plástico interior de la pajita exterior y sumérjalo rápidamente en WS1, girando suavemente para descargar los folículos en 10 segundos.

Después de dos minutos en WS1, use una micropipeta para transferir folículos o grupos de folículos a WS2 para una incubación de tres minutos. Luego transfiéralos a un plato FCM e incube los folículos durante una o dos horas en el centro antes de incrustarlos, Para el calentamiento CL del portador abierto, repita la preparación del plato FCM y WS. Transfiera el bastón criogénico a una caja criogénica y retire la cubierta de plástico del bastón.

Use una varilla magnética para levantar la tapa del vial criogénico hasta que el vástago metálico del CL sea visible. Sujete la tapa con el soporte CL adjunto con la varilla magnética. Y sumerja rápidamente el CL en WS1, girando para descargar los folículos en 10 segundos.

El crecimiento del folículo preantral se mantuvo en el cultivo tridimensional de gel de hialurónico, preservando la arquitectura del folículo nativo con un antro visible el día 12. Los folículos encapsulados en gel de hialuronano exhibieron expansión radial debido a la proliferación de células de granulosis con diámetros de folículos que aumentaron de alrededor de 139,8 micrómetros a 385,6 micrómetros durante el período de cultivo. Metafase ovulada Se encontraron dos ovocitos cerca del folículo después del desencadenamiento de la gonadotropina coriónica humana.

Los ovocitos medían aproximadamente 84,8 micrómetros de diámetro. Con ovarios frescos, tanto los folículos individuales como los grupos de folículos exhibieron buenas tasas de maduración. Los grupos de folículos de ovarios criopreservados exhibieron tasas de maduración más bajas, lo que condujo a la extrusión prematura de ovocitos.

La criopreservación de folículos aislados fue más efectiva que la preservación de todo el ovario. La vitrificación de folículos en ambos portadores logró altas tasas de maduración, independientemente de las diferencias en la velocidad de enfriamiento. El sistema de portador abierto CL permitió una criopreservación eficiente de múltiples folículos, reduciendo el tiempo de procesamiento.