Generación de esferoides/organoides tridimensionales a partir de cultivos celulares bidimensionales utilizando un novedoso dispositivo de estampado

El alcance de nuestra investigación es establecer un protocolo eficiente y reproducible para la generación de cultivos celulares tridimensionales utilizando un innovador sistema de micropocillos basado en pasos en moldes de agarosa. Nuestro objetivo es responder cómo crear un entorno simplificado y controlado que promueva cultivos 3D uniformes y de alta calidad para pruebas de medicamentos, ingeniería genética y aplicaciones relacionadas. Los avances recientes en los sistemas de cultivo celular en 3D mejoran las interacciones celulares y crean más entornos similares a los in vivo.

Este enfoque mejora la formación de organoides esferoides, lo que lo convierte en una herramienta prometedora para la investigación biomédica. Las tecnologías actuales para el cultivo celular en 3D incluyen gotas colgantes, cultivo celular rotativo, plásticos de baja fijación, placas con pozos cónicos, andamios microporosos, perlas magnéticas e hidrogeles sin andamios. Estos métodos permiten la formación de estructuras celulares en 3D, cada una con sus propias ventajas y limitaciones.

Nuestro protocolo aborda el desafío de generar esferoides y organoides 3D uniformes con tamaño y calidad consistentes a gran escala. Resuelve los problemas de viabilidad y densidad celular, las dificultades de manejo y la inestabilidad durante el proceso, demostrando ser una solución rentable y reproducible para la investigación confiable de cultivos celulares en 3D. Estamos comprometidos con la búsqueda de mejoras en las herramientas de investigación, la generación de organoides esferoides de células beta productoras de insulina para el análisis in vitro y la encapsulación en biopolímeros, con el objetivo de la reversión de la diabetes tipo I y la generación de organoides esferoides a partir de células de cáncer de mama humano triple negativo como plataforma de cribado de fármacos antes del tratamiento del paciente.

Diseñe el dispositivo de sello utilizando el software especificado. Lave el sello hecho a medida con una esponja de cerdas suaves y agua destilada para eliminar cualquier residuo. Exponga el sello limpio a la luz ultravioleta durante cinco a 10 minutos para garantizar la esterilidad.

Para preparar una solución de 1 a 2% de agarosa, pese la cantidad requerida de polvo de agarosa pura y disuélvalo en PBS. Calienta la solución en el microondas hasta que la agarosa se disuelva por completo. A continuación, pipetee aproximadamente tres mililitros de la solución de agarosa a 40 grados centígrados en cada pocillo de una placa de seis pocillos.

Coloque el sello en el centro del pozo y deje que la agarosa se solidifique durante 5 a 10 minutos. Después de la solidificación, retire el sello con suaves movimientos hacia adelante y hacia atrás para liberar el vacío sin dañar los micropocillos. Lave los micropocillos tres veces con PBS para eliminar los residuos.

Exponga la placa a la luz ultravioleta durante 10 minutos para eliminar la contaminación microbiana. Agregue tres mililitros de medio de cultivo a cada pocillo de la placa de seis pocillos e incube la placa durante la noche a 37 grados Celsius en una incubadora de dióxido de carbono. Para obtener una suspensión homogénea de islotes pancreáticos porcinos, se añade tripsina a un cultivo celular bidimensional para disociar las células.

Luego, cuente las celdas y ajuste la concentración para lograr el número deseado de celdas por micropocillo de una placa de seis pocillos. Pipetear tres mililitros de la suspensión celular sobre los micropocillos de agarosa y agitar la placa para asegurar una distribución uniforme. Deje que las células se asienten por gravedad durante 10 a 15 minutos.

Luego, observe las células asentadas bajo el microscopio. Incubar la placa a 37 grados centígrados en una incubadora de dióxido de carbono al 5%. Cada dos o tres días, reemplace el 50% del medio viejo o gastado por medio nuevo.

Continúe cultivando hasta que las estructuras compactas y tridimensionales estén completamente formadas. Para recolectar esferoides u organoides, retire el medio de cultivo y, con una punta de pipeta cortada, recoja las estructuras tridimensionales mediante un pipeteo vigoroso. Las estructuras tridimensionales compactas se formaron con éxito mediante 48 horas de cultivo en micropocillos de agarosa, según se observó a través de la agregación celular dependiente del tiempo.

Las estructuras tridimensionales viables se conservaron tras la extracción de los micropocillos de agarosa con tinción verde que indica células vivas dentro de las estructuras, lo que confirma la viabilidad y estabilidad de las células.