Criosección directa de cabezas de Drosophila para mejorar la tinción de fluorescencia cerebral y la inmunotinción

Nuestro equipo estudia el trastorno metabólico, cardíaco, muscular del sueño y del envejecimiento utilizando el modelo de Drosophila. Este artículo de Jove detalla el protocolo simplificado para el procesamiento del tejido cerebral, incluida la decapitación, la fijación, la criosección, la tinción y la obtención de imágenes. Mi grupo de investigación ha sido pionero en el desarrollo del modelo de Drosophila para estudiar varias enfermedades humanas y el envejecimiento.

También hemos investigado intervenciones como la alimentación restringida en el tiempo y el ejercicio. Utilizamos el aprendizaje automático, la ómica y el enfoque molecular para estudiar factores como el ritmo circadiano y la genética para revelar su impacto en la integridad celular, la fisiología y el comportamiento. Este protocolo simplificado de investigación del cerebro de Drosophila evita disecciones complejas, requiere la ejecución con una sola mano y elimina la necesidad de una costosa microscopía confocal, lo que aumenta la accesibilidad y reduce la dependencia del equipo.

Para comenzar, obtenga las moscas en frascos envejecidos, luego abra la válvula en la alfombra de dióxido de carbono y vierta rápidamente las moscas en la alfombra para evitar que se escapen. Una vez que las moscas estén casi inconscientes, colóquelas debajo del microscopio SZ61 moviendo la alfombrilla debajo de la lente del objetivo. Ajuste el aumento y el enfoque hasta que las moscas sean claramente visibles y cómodas de decapitar.

Con unas tijeras de resorte, coloque las cuchillas entre el tórax y la cabeza de la mosca y apriételas firmemente para decapitar de cinco a 10 cabezas de mosca por grupo experimental. Vuelva a colocar las moscas usadas en su frasco envejecido. Con un cepillo, transfiera suavemente las cabezas de mosca decapitadas a tubos etiquetados de 1,5 mililitros colocados sobre hielo.

Después de retirar los tubos del hielo, pipetee 100 microlitros de paraformaldehído al 4% y PBS en cada tubo, asegurándose de que todas las cabezas de mosca estén completamente sumergidas. Si las cabezas se adhieren a las paredes del tubo, empújelas suavemente hacia abajo con un cepillo o golpee ligeramente el tubo contra una superficie horizontal para asegurar un contacto adecuado con la solución. A continuación, incubar los tubos durante 15 minutos en un agitador orbital a temperatura media.

Deseche la solución de paraformaldehído y reemplácela con PBS, asegurándose de que todas las cabezas de mosca estén sumergidas. Después del lavado final, transfiera las cabezas de mosca a una solución de sacarosa al 10% en PBS, asegurándose de que estén sumergidas dentro del tubo. Llene un molde etiquetado hasta aproximadamente el 50% de su capacidad con una temperatura de corte óptima o un compuesto OCT, permitiendo que se extienda a las cuatro esquinas del molde.

Con un cepillo, coloque con cuidado las cabezas de mosca fijas recolectadas sobre la superficie del compuesto OCT dentro del molde. Con la punta de las pinzas, empuje suavemente cada cabeza hacia el fondo del molde, asegurándose de que los ojos estén orientados hacia abajo para un corte a través del plano coronal. Alinee cuidadosamente todas las cabezas en las dimensiones X, Y y Z para asegurarse de que todas las secciones contengan todos los grupos experimentales simultáneamente.

Después de alinear las cabezas correctamente, coloque cuidadosamente los moldes directamente en un congelador a menos 20 grados centígrados para congelar. Una vez que el molde se haya congelado en su mayor parte, llene el espacio restante con compuesto OCT. Para la crisección de moldes, aplique una cantidad generosa de compuesto OCT en la parte superior del molde para unir la broca del mandril al molde.

Coloque la broca plana en la parte superior y deje que se congele completamente dentro del criostato, lo que generalmente tarda cinco minutos. A continuación, suelte la broca y el bloque OCT del molde. Coloque el bloque en el mandril, asegurándose de que se mantenga la orientación adecuada de arriba a abajo y apriete la llave del mandril hasta que el bloque esté firmemente en su lugar.

Usando las perillas de ajuste y los controles de profundidad del mandril, alinee el bloque con la hoja. Establezca el ancho de la sección en el criostato a 20 micrómetros y corte cada rebanada con un movimiento lento y consistente mientras permite que el vidrio estabilizador capture cada rebanada. A continuación, capture las secciones con diapositivas cálidas tocando la diapositiva hasta el borde más cercano de la sección y permitiendo que la sección se eleve sobre la diapositiva.

Deje que los portaobjetos se sequen a temperatura ambiente durante al menos 30 minutos, pero no más de una hora. Tome las cabezas de mosca Drosophila crioseccionadas y use una cuchilla de afeitar para eliminar cualquier compuesto OCT residual en los bordes del portaobjetos, dejando espacio para un borde hidrofóbico. A continuación, utiliza un rotulador hidrofóbico para dibujar un borde alrededor de cada portaobjetos y déjalo secar durante cinco minutos.

Lave todos los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS pipeteando suavemente el portaobjetos. Después de lavar los portaobjetos, pipetee 3%BSA en solución salina tamponada Tris sobre los portaobjetos e incube durante 30 minutos a una hora. A continuación, deseche la solución de bloqueo y pipetee la solución de anticuerpo primario en los portaobjetos.

Incubar el anticuerpo durante la noche a cuatro grados centígrados o durante una hora a temperatura ambiente con toallitas húmedas para evitar que se sequen. Deseche la solución de anticuerpos primarios y lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS. A continuación, añada la solución de anticuerpos secundarios a los portaobjetos e incube durante una hora a temperatura ambiente.

Después de lavar los portaobjetos tres veces con PBS, deje solo una pequeña cantidad de PBS en el portaobjetos. A continuación, con una pipeta de 1000 microlitros, añada de tres a cinco gotas de medios de montaje de endurecimiento que contengan DAPI de manera uniforme en todo el portaobjetos. Coloque un cubreobjetos en el portaobjetos asegurándose de que no se formen burbujas de aire durante la colocación.

Manipule con cuidado las guías recién montadas y guárdelas planas hasta que el medio de montaje esté completamente seco. Si se necesita almacenamiento a largo plazo, selle los bordes de los portaobjetos. Capture imágenes de los portaobjetos lo antes posible para minimizar la desintegración fluorescente.

Durante la adquisición de imágenes, concéntrese en cada sujeto único en el mismo canal para mantener la coherencia en todos los grupos experimentales. Calibra las exposiciones de cada canal para evitar la sobreexposición en todos los canales seleccionados. Asegúrese de que las exposiciones seleccionadas permanezcan constantes y sean apropiadas para todos los sujetos, especialmente entre diferentes grupos experimentales.

La expresión de la marca de anticuerpos ApoE se localizó claramente en las regiones cerebrales de los especímenes Elav+ y Elav-ApoE4. La acumulación de lípidos fue indicada por la tinción de rojo del Nilo, que fue visible en las regiones del cerebro en ambos genotipos.