Anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a partir de moléculas individuales para caracterizar la flexibilidad local en biomoléculas

Esta investigación tiene como objetivo estudiar la flexibilidad local y la dinámica de las biomoléculas a nivel de molécula única, utilizando anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo en modo de microscopía confocal. La detección y localización de moléculas individuales ha permitido la observación de biomoléculas, pero la captura de su dinámica requiere otros enfoques. Los métodos de fluorescencia resueltos en el tiempo ayudan a llenar ese vacío.

Herramientas comunes para estudiar experimentalmente la dinámica biomolecular, incluidos el traste de molécula única y la RMN. A nivel de molécula única, varios análisis, procesos, la emisión fluorescente fotón por fotón, Estos incluyen análisis resueltos en el tiempo y análisis de varianza de ráfaga.

El uso de múltiples fluoróforos para experimentos smFRET puede introducir complejidades en el diseño experimental y en la fabricación de muestras de calidad suficientemente buena. El uso de una sola etiqueta y anisotropía de fluorescencia resuelve algunas de estas complejidades.

Encontramos que la forma monomérica del dominio forkhead del FoxP1 humano se comporta como una proteína desordenada y aumenta su población de plegamiento cuando se dimeriza.

[Instructor] Para comenzar, filtre la solución tampón estándar preparada a través de un filtro de tamaño de poro de 0,22 micrómetros. Luego filtre el tampón estándar a través de un filtro de carbón para la adquisición de una sola molécula. Para las sondas fluorescentes, prepare alícuotas de pequeño volumen del BODIPY Fluorescent Pro preparado. Para calibrar la configuración resuelta de polarización, primero, encienda los canales del detector paralelo y perpendicular y encienda el láser azul. Asegúrese de que la potencia del láser esté configurada en 60 microvatios y abra el panel de control del software TCSPC o de conteo de fotones individuales correlacionado con el tiempo. A continuación, mezcle un microlitro de rodamina 110 100 nanomolar con 49 microlitros de agua destilada. Agregue una gota de líquido de inmersión encima de la lente del objetivo del microscopio. Coloque el cubreobjetos en el objetivo del microscopio y asegúrese de que la gota de agua esté centrada en la lente. Agregue 50 microlitros de la solución diluida de rodamina 110 al centro del vidrio de cobertura para mediciones de calibración. Ajuste el plano de la imagen para que esté dentro de la solución y por encima de la superficie del vidrio. Con la perilla de enfoque, ubique el segundo punto focal brillante y ajústelo a 1 1/2 vueltas. Ahora abra el software en modo Time-Tagged Time-Resolved y haga clic en el botón START. Registre la velocidad de conteo durante 120 segundos. Para mediciones de fondo, agregue 50 microlitros de agua destilada al centro del vidrio de cubierta y repita la adquisición. Registre la tasa de recuento de fotones durante 300 segundos y guarde el archivo como water.ptu. Para mediciones de fondo adicionales, agregue 50 microlitros de tampón estándar al centro de la cubierta de vidrio. Registre la tasa de recuento de fotones durante 300 segundos y guarde el archivo como standard_buffer.ptu. Ahora inicie el software de análisis Burst Integration Fluorescence Lifetime, BIFL, y haga clic en Confirmar la configuración desde la ventana automática. A continuación, haga clic en Obtener parámetros del archivo y, a continuación, haga clic en Aceptar. Para seleccionar la medida que desea analizar, haga clic en Data Path Array y seleccione el conjunto de datos adecuado. Ahora cargue el archivo water.ptu de medición de agua para matrices, como Green Scatter, el archivo standard_buffer.ptu para el fondo verde y Rhodamine110.ptu para Green thick. en los parámetros de selección de molécula única, haga clic en Siguiente, luego en Ajustar para abrir una nueva ventana emergente. Luego presione Umbral para modificar el tiempo de llegada del interfotón y elija el tiempo de evento de molécula única para el tiempo medio de llegada del interfotón. Ahora haga clic en el número mínimo para establecer el número mínimo de fotones por evento de molécula individual. Luego cierre la ventana emergente haciendo clic en Retorno y Aceptar. Haga clic en Parámetros de ajuste de color para ajustar la vida útil de fluorescencia inicial para el verde y otros colores utilizando parámetros de decaimiento de fluorescencia. Modifique, solicite y retrase los valores ajustando los valores de origen y destino y cierre la ventana emergente. Finalmente, presione Guardar para procesar los archivos ASCII y guardarlos en la carpeta seleccionada. Transfiera un pre-inóculo nocturno de Escherichia coli C41 a 500 mililitros de medio LB con antibiótico preagregado en una proporción de dilución de 1:500. Mida la absorbancia del cultivo a 600 nanómetros para monitorear el crecimiento del cultivo. Cuando la densidad óptica alcance entre 0,5 y 0,7, agregue IPTG a una concentración final de 0,5 milimolares para inducir la expresión de proteínas e incube. Centrifugar las células bacterianas a 3.000 g durante 20 minutos a cuatro grados centígrados cuando el cultivo alcance una densidad óptica de 1,4 a 1,6. Después de desechar el sobrenadante, guarde el gránulo a menos 20 grados centígrados hasta su uso. A continuación, agregue de 50 a 100 micromolares de proteína FoxP1 a un exceso molar diez veces mayor de DTT o TCEP e incube. Coloque una columna de desalinización PD-10 en un tubo de centrífuga de 50 mililitros utilizando un adaptador de columna para el intercambio de tampones. Agregue cinco mililitros de tampón PBS a la columna para equilibrarlo y centrifugarlo a 1,000 g durante dos minutos. Transfiera la columna PD-10 a un tubo nuevo de 50 mililitros y agregue dos mililitros de tampón PBS a la columna. Ahora cargue 500 microlitros de proteína FoxP1 en la columna. Eluya la columna centrifugando a 1.000 g durante dos minutos para recoger la proteína purificada. Transfiera la proteína a un filtro ultracentrífugo de corte de peso molecular de 10 kilodalton. Después de centrifugar a 7.500 g durante 10 minutos, recoger el eluido concentrado. Mida la concentración de proteínas. Luego agregue BODIPY e incube a cuatro grados centígrados durante dos horas en un rotador. Repita el intercambio de tampones y la concentración de proteínas. Después de determinar la concentración de proteína, mida el grado de etiquetado utilizando la fórmula. Agregue 495 microlitros de agua ultrapura y cinco microlitros de Tween 20 en un pozo de un portaobjetos de cámara y mezcle bien. Después de una incubación de 30 minutos a temperatura ambiente, lave suavemente la cámara con agua ultrapura dos veces y séquela. Para corregir la fluorescencia de fondo, realice mediciones de una solución tampón. Calibre la sensibilidad relativa de los detectores paralelos y perpendiculares adquiriendo datos de un colorante de rotación rápida Para experimentos de anisotropía de fluorescencia de una sola molécula en FoxP1 monomérico, agregue 100 FoxP1 picomolares marcados con BODIPY y 100 nanomolares sin marcar FoxP1 a 500 microlitros de tampón estándar en un portaobjetos de cámara. Comience las mediciones y verifique en el software BIFL que el número de ráfagas registradas en 30 segundos esté entre 60 y 90. Si la muestra está más concentrada, dilúyala hasta que el recuento de ráfagas caiga dentro de este rango. Finalmente, analice las mediciones. El análisis de la vida útil de la anisotropía de fluorescencia de una sola molécula reveló una distribución única que se origina a partir de dos tiempos de correlación rotacional distintos en el dominio de unión al ADN FoxP1, lo que sugiere la coexistencia de conjuntos estructurales ordenados y desordenados. El análisis de varianza de ráfagas identificó un subconjunto de moléculas de FoxP1 que exhibían alta anisotropía y exceso de variantes, lo que sugiere la presencia de cambios conformacionales dinámicos. El análisis de distribución de fotones diferenció entre estados FoxP1 monoméricos y diméricos, mostrando distribuciones de anisotropía y tipos de cambio distintos. La dimerización influyó en los movimientos locales y globales en FoxP1 con mediciones de varianza excesiva que indican cambios anisotrópicos significativos en sitios específicos marcados con cisteína. El análisis de anisotropía dinámica reveló que FoxP1 sufre un despliegue parcial tras la dimerización y la unión al ADN, alterando la fracción de poblaciones estructuradas y desordenadas.