Name: Anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a partir de moléculas individuales para caracterizar la flexibilidad local en biomoléculas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-04-25T13:40:00.000+00:00
Duration: 10 min 23 s
Description: Aprende a caracterizar la flexibilidad local en biomoléculas mediante anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a nivel de moléculas individuales. Este método permite estudiar dinámica proteica con alta precisión.

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<table><tbody><tr><td>Alexa Fluor 488</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>A20100</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/A20100?SID=srch-srp-A20100</td></tr><tr><td>Filtro ultra Amicon Centrífugo, 10 kDa MWCO</td><td>Millipore Sigma</td><td>UFC901008</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/ufc9010</td></tr><tr><td>Ampicilina sal de sodio</td><td>Millipore Sigma</td><td>A0166-5G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/a0166</td></tr><tr><td>BODIP FL Maleimida (BODIPY FL N-(2-aminoetil))Maleimida)</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>B10250</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/B10250?SID=srch-srp-B10250</td></tr><tr><td>Columnas de desalinización desechables PD 10</td><td>Millipore Sigma</td><td>GE17-0851-01</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/ge17085101</td></tr><tr><td>Ditiotreitol</td><td>Millipore Sigma</td><td>10197777001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/dttro</td></tr><tr><td>DMSO, ADN anhidro</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>D12345</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/D12345?SID=srch-srp-D12345</td></tr><tr><td></td><td>Millipore Sigma</td><td>10104159001</td><td></td></tr> <tr><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/10104159001E. coli Células bacterianas C41</td><td>Invitrogen</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Foresigh Nuvi Ni-Charged IMAC, columna de 5 ml</td><td>Bio-Rad 12004037</td><td></td><td>https://www.bio-rad.com/en-us/sku/12004037-foresight-nuvia-ni-charged-imac-5-ml-column?ID=12004037</td></tr><tr><td>HEPES</td><td>Millipore Sigma</td><td>7365-45-9</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/h3375</td></tr><tr><td>Imidazol</td><td>Millipore Sigma</td><td>288-32-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/i5513</td></tr><tr><td>IPTG</td><td>Millipore Sigma</td><td>I6758-1G</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sial/i6758</td></tr><tr><td>Filtro de Membrana MCE, 0.22 &mu; m Tamaño de poro</td><td>Millipore Sigma</td><td>GSWP02500</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/gswp02500</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Millipore Sigma</td><td>7647-14-5</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3014</td></tr><tr><td>Nunc Lab-Tek II Sistema de portaobjetos</td><td>de cámara ThermoFisher Scienctific</td><td>154534</td><td></td></tr><tr><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/154534 OverExpress C41(DE3) Químicamente Células competentes</td><td>Millipore Sigma</td><td>CMC0017-20X40UL</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/cmc0017</td></tr><tr><td>PMSF</td><td>Millipore Sigma</td><td>329-98-6</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/78830</td></tr><tr><td>Rhodamine 110</td><td>ThermoFisher Scienctific</td><td>419075000</td><td>https://www.thermofisher.com/order/catalog/product/419075000?SID=srch-hj-419075000</td></tr><tr><td>Sodium fosfato dibásico</td><td>Millipore Sigma</td><td>7558-79-4</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/s3264</td></tr><tr><td>Fosfato de sodio monobásico dihidrato</td><td>Millipore Sigma</td><td>13472-35-0</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/sigma/71505</td></tr><tr><td>TCEP, clorhidrato, grado reactivo</td><td>Millipore Sigma</td><td>580567-5GM</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/mm/580567</td></tr><tr><td>Interpolación 20</td><td>Millipore Sigma</td><td>11332465001</td><td>https://www.sigmaaldrich.com/US/en/product/roche/11332465001</td></tr></tbody></table>

anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a partir de moléculas individuales para caracterizar la flexibilidad local en biomoléculas

Time-Resolved Fluorescence Anisotropy from Single Molecules for Characterizing Local Flexibility in Biomolecules

La anisotropía de fluorescencia surge de la orientación relativa de la absorción del fluoróforo y los momentos dipolares de emisión. Cuando los fluoróforos se exponen a luz polarizada, los fluoróforos con momentos de transición de absorción alineados con el vector de campo eléctrico de la luz incidente se excitan preferentemente (fotoselección). En consecuencia, la población de estado excitado se orienta parcialmente, con una fracción significativa de las moléculas excitadas que tienen sus momentos de transición alineados con el vector de campo eléctrico de la luz excitante polarizada61. Los fluoróforos rotan debido a su movimiento browniano. Por lo tanto, el momento de transición de la emisión también gira, lo que resulta en una dependencia del tiempo de la anisotropía de fluorescencia. Este efecto se puede utilizar para medir los movimientos de rotación de las moléculas fluorescentes, detectar eventos de unión, caracterizar el entorno del fluoróforo y capturar la dinámica molecular.
Los experimentos de una sola molécula están preparados de manera única para determinar la heterogeneidad de la muestra. Aprovechando la sensibilidad de una sola molécula y la anisotropía de fluorescencia, se añade otra dimensionalidad a la espectroscopia de fluorescencia multiparamétrica. En un microscopio confocal típico de una sola molécula (Figura 2)20,21, la anisotropía de fluorescencia se puede determinar mediante la intensidad o la resolución temporal cuando se utilizan láseres pulsados.
Para considerar los efectos despolarizantes del objetivo de apertura numérica alta en un microscopioconfocal 62, la forma adecuada de la anisotropía resuelta en el tiempo35,63 viene dada por
<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq01.jpg" style="margin: auto;">(1)
donde <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq02.jpg" style="margin: auto;"> y <img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq03.jpg" style="margin: auto;"> son la intensidad de fluorescencia resuelta en el tiempo en el canal de detección y-ésimo después de la excitación en la longitud de onda x, para la polarización paralela y perpendicular l1 y l2 y son factores que describen la mezcla entre las señales paralelas y perpendiculares debido al objetivo de alta apertura numérica (NA) utilizado en estas mediciones35,62, Artículo 64. Las diferencias en las eficiencias de detección del canal de detección paralelo, <img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq04.jpg" style="margin: auto;">, y perpendicular, <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq05.jpg" style="margin: auto;">, para el colorante se corrigen con la relación de las eficiencias de detección, <img alt="Equation 6" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq06.jpg" style="margin: auto;">. El G UV también se conoce como factor G.
La anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo se puede modelar utilizando una desintegración multiexponencial para explicar que el fluoróforo se une a una biomolécula más grande como
<img alt="Equation 7" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq07.jpg" style="margin: auto;">,     (2)
donde r0 es la anisotropía fundamental dependiente del fluoróforo (típicamente r0 = 0,38), r∞ es la anisotropía residual, y ρ1 y ρ2 son tiempos de correlación rotacional rápidos (movimientos locales del fluoróforo) y lentos (movimiento global de la macromolécula), respectivamente.
En las mediciones de anisotropía de una sola molécula (Figura 2), los tiempos de llegada de los fotones se registran para identificar emisores individuales mediante el análisis de vida útil de fluorescencia integrada en ráfagas (BIFL) 33,35. Los tiempos de llegada entre fotones (Δt) se suavizan utilizando un promedio móvil y luego se trazan para ayudar a la visualización. El histograma de estos tiempos está equipado con un medio gaussiano para determinar la media y la desviación estándar de los fotones que se originan en el fondo. Se utiliza un umbral arbitrario, establecido en múltiplos de la desviación estándar, para filtrar eventos individuales mientras se identifican el primer y el último fotón en cada ráfaga. A continuación, los fotones dentro de cada ráfaga se integran para su posterior análisis, que incluye el cálculo de la anisotropía de fluorescencia en estado estacionario resuelta en el tiempo y basada en la intensidad utilizando las ecuaciones 1 y 2 o mediante un estimador de máxima verosimilitud35. Debido al número limitado de fotones en eventos de una sola molécula, el estimador de máxima verosimilitud considera solo un solo componente exponencial y no se discutirá más a fondo.
En un histograma bidimensional de eventos de una sola molécula, el tiempo de vida medio de la fluorescencia (τ) y la anisotropía (rxy) se pueden relacionar mediante la ecuación de Perrin29,61 para obtener (ρ) como un tiempo de rotación promedio.
<img alt="Equation 8" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq08.jpg" style="margin: auto;">(3)
Los valores específicos de ρ se pueden obtener con mayor certeza mediante un análisis de "subconjunto" (se) donde los fotones de diferentes ráfagas se integran en una desintegración combinada de anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo que se puede analizar optimizando los parámetros de la ecuación 2 para la desintegración experimental (seTRFA). La anisotropía resuelta en el tiempo puede resolver la heterogeneidad y la dinámica asociadas con los movimientos de rotación (locales y globales) de las biomoléculas dentro de la emisión de fluorescencia que ocurre dentro del marco de tiempo ns.
Para detectar la dinámica dentro de eventos de una sola molécula (en la escala de submilisegundos), introdujimos el análisis de varianza de ráfaga de anisotropía resuelto en el tiempo (traBVA)57. En traBVA, para una ráfaga de fotones que contiene Mi segmentos de fotones consecutivos, la varianza del exceso de anisotropía (s2) para las ráfagas es
<img alt="Equation 9" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq09.jpg" style="margin: auto;">.     (4)
Para un solo estado anisotrópico, la varianza σ2 surge únicamente del ruido de disparo65 (sn: √N, donde N es el número de fotones)
<img alt="Equation 10" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq10.jpg" style="margin: auto;">(5)
donde m es el número de fotones en una ráfaga. Por lo tanto, para identificar la varianza adicional en la anisotropía, podemos definir el exceso de varianza de anisotropía (S2) debido a la heterogeneidad conformacional como la diferencia entre las ecuaciones 4 y 5.
<img alt="Equation 11" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq11.jpg" style="margin: auto;">(6)
Para capturar la dinámica que ocurre dentro de la observación de moléculas individuales y considerar la aproximación de la varianza, se puede utilizar el Análisis de Distribución de Fotones de Anisotropía Dinámica (daPDA)55,56. En daPDA, la intensidad de fluorescencia se modela siguiendo una probabilidad condicional (<img alt="Equation 12" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq12.jpg" style="margin: auto;">) expresada como una distribución binomial.
<img alt="Equation 13" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq13.jpg" style="margin: auto;">(7)
Junto con una estimación de la tasa de recuento de fondo que sigue una distribución de Poisson
<img alt="Equation 14" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq14.jpg" style="margin: auto;">(8)
donde <img alt="Equation 15" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq15.jpg" style="margin: auto;"> es el número promedio de fotones de fondo por ventana de tiempo establecida. Los recuentos de fondo paralelos y perpendiculares, <img alt="Equation 16" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq16.jpg" style="margin: auto;"> y <img alt="Equation 17" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq17.jpg" style="margin: auto;">, se pueden medir utilizando muestras de tampón como referencia. La anisotropía de fluorescencia determinada experimentalmente se optimiza minimizando una figura de mérito χ2 con una distribución de intensidad de fluorescencia por canal de polarización que puede incluir cambios cinéticos.
Las rutinas de análisis y las representaciones de datos proporcionadas ofrecen un enfoque integral para interpretar los datos recopilados. Aunque este protocolo se centra principalmente en las mediciones confocales, que están limitadas para capturar los cambios de anisotropía de nanosegundos a milisegundos, es posible adoptar un microscopio de reflexión interna total para monitorear la anisotropía de fluorescencia en escalas de tiempo más largas, lo que permite el análisis de series de tiempo66. Para las mediciones confocales de una sola molécula, destacamos el uso de histogramas multidimensionales que crean una huella digital única del conjunto observado. Las desintegraciones de fluorescencia resueltas en el tiempo, reconstruidas a partir de poblaciones seleccionadas, pueden rastrear la evolución de la anisotropía de fluorescencia a escala de nanosegundos (Figura 3). El análisis de distribución de fotones55,56 y el análisis de varianza de ráfagas (BVA)57,58 también pueden capturar la dinámica en escalas de tiempo intermedias entre decaciones resueltas en el tiempo e histogramas multidimensionales. Si bien este protocolo no cubre el uso de la espectroscopia de correlación de fluorescencia de polarización (FCS), con o sin excitación pulsada67,68, que puede unir las escalas de tiempo de nanosegundos a milisegundos, los mismos datos se pueden usar para calcular FCS69, aunque esto queda fuera del alcance del protocolo presentado. Si se llevan a cabo tales experimentos, se recomienda un tiempo de medición de la muestra más largo.
Este enfoque se ha aplicado a un sistema complejo como las proteínas FoxP humanas, proporcionando información valiosa sobre los movimientos involucrados en su mecanismo de acción. Las proteínas FoxP son factores de transcripción implicados en varios aspectos fisiológicos como el desarrollo cerebral y pulmonar; Es importante destacar que se han reconocido diferentes mutaciones que perjudican la función de estas proteínas70,71. Utilizando el dominio de unión al ADN de FoxP1 como modelo, generamos diferentes mutantes de cisteína única para introducir un colorante BODIPY-FL como rastreador de movimientos (Figura 4A). De hecho, evaluamos el efecto de la dimerización y la unión al ADN como principales reguladores estructurales de esta proteína. Utilizando el enfoque smFA, generamos gráficos 2D-smFA y creamos traBVA y daPDA para cada mutante en condiciones monoméricas y diméricas. Mostramos un ejemplo de uno de los mutantes individuales estudiados (Figura 4). El comportamiento de la anisotropía es similar en todos los mutantes en cuanto a la determinación de tiempos de correlación rotacional altos y bajos y, por lo tanto, conjuntos presumibles, desordenados y plegados. Sin embargo, también es muy heterogéneo en todos los mutantes en cuanto a la fracción y cinética de cada conjunto, evidenciando diferentes cambios de transición de orden a desorden influenciados por la dimerización y la unión al ADN, y muestra la descripción a alta resolución de la dinámica estructural a lo largo de la cadena (Figura 5).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig01.jpg"> 
Figura 1: Rango dinámico de biomoléculas y métodos de anisotropía de fluorescencia. (A) La anisotropía de pequeños fluoróforos unidos a varias posiciones a lo largo de la columna vertebral de la biomolécula de interés informa la dinámica estructural local. (B) Escalas de tiempo sondeadas por decaimientos de intensidad de fluorescencia (anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo, FA) e histogramas de una sola molécula de datos de microscopio confocal de una sola molécula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig02.jpg"> 
Figura 2: Registro y procesamiento de datos de anisotropía de fluorescencia de una sola molécula. (A) Las moléculas de difusión libre se analizan utilizando un microscopio confocal de una sola molécula equipado con un solo láser de excitación polarizado linealmente (azul en nuestro caso). La emisión de fluorescencia (verde en nuestro caso) es detectada por dos detectores después de que un polarizador de haz divide la señal en dos polarizaciones (paralela <img alt="Equation 18" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq18.jpg" style="margin: auto;">, , y perpendicular, <img alt="Equation 19" src="/files/ftp_upload/67802/67802eq19.jpg" style="margin: auto;">, a la fuente de excitación). (B) Cada fotón detectado se caracteriza por tres parámetros: micro tiempo, macro tiempo y tipo de canal. Los datos se almacenan en un formato de tiempo resuelto con etiqueta de tiempo (TTTR)72. (C) Se seleccionan y procesan ráfagas de moléculas individuales para extraer los parámetros de fluorescencia, incluida la anisotropía de fluorescencia para cada molécula observada. (D) Los datos se representan de múltiples maneras, incluidos gráficos bidimensionales de anisotropía de fluorescencia frente a la vida útil de la fluorescencia y desintegraciones de anisotropía resueltas en el tiempo. Estas representaciones permiten la determinación visual y cuantitativa de los tiempos de vida de fluorescencia, los tiempos de correlación rotacional y la heterogeneidad del sistema. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig03.jpg"> 
Figura 3: Datos representativos del dímero de intercambio de dominio FoxP1. (A) Correlación de la anisotropía de fluorescencia (dispersión r) contra el tiempo de vida medio de fluorescencia por molécula como un gráfico de contorno. Superposición de una sola ecuación de Perrin para dos componentes rotacionales como representante del promedio del conjunto de la molécula, considerando ρ1 y ρ 2 de 0,2 ns y 8,5 ns, respectivamente. (B) Las desintegraciones de fluorescencia resueltas en el tiempo de subconjuntos se utilizan para calcular la anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo de la muestra. El ajuste con la ecuación 2 resolvió los componentes locales y globales de la anisotropía de fluorescencia. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig04.jpg"> 
Figura 4: Dinámica de FoxP1 en submilisegundos monitoreada utilizando anisotropía de fluorescencia de una sola molécula (smFA). (A) Una representación de dibujos animados de la estructura monomérica de FoxP1. (B) Un histograma bidimensional ilustra la heterogeneidad dinámica, revelando dos tiempos de correlación rotacional distintos identificados a través de la anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo. El análisis de varianza de ráfaga de anisotropía resuelta en el tiempo (traBVA) descubre un pequeño subconjunto de eventos con exceso de varianza (Ec. 6) que exhiben una gran anisotropía. El análisis cuantitativo de anisotropía dinámica mediante el análisis de distribución de fotones (PDA) extrae aún más los tipos de cambio para este proceso. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67802/67802fig05.jpg"> 
Figura 5: Cribado de los movimientos locales y globales de FoxP1 durante la dimerización. (A) Una representación de dibujos animados compara el FoxP1 monomérico con su forma dimérica. (B) Se muestra el exceso de varianza media por ubicación en condiciones monoméricas y diméricas, con un mayor exceso de varianza que indica cambios más significativos en la anisotropía. (C) El análisis dinámico de anisotropía mediante el análisis de distribución de fotones (PDA) ayuda a determinar las fracciones de población (alta anisotropía en colores oscuros y baja anisotropía en colores claros) en ausencia (verde) y presencia (amarillo) de ADN. En este enfoque, se estimaron las tasas (no mostradas) para las transiciones entre comportamientos locales y globales, revelando que FoxP1 experimenta un despliegue parcial. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67802/67802fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Anisotropía de fluorescencia resuelta en el tiempo a partir de moléculas individuales para caracterizar la flexibilidad local en biomoléculas

We describe a protocol for conducting time-resolved fluorescence anisotropy at the single-molecule level using confocal microscopy to investigate the ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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