Name: Ajuste fino de la orientación de Caenorhabditis elegans en almohadillas de agar canalizadas para la neurorregeneración de imágenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-31T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 12 s
Description: Aprende a fabricar moldes de PDMS para crear almohadillas de agar canalizadas que orientan Caenorhabditis elegans con precisión. Este método mejora la calidad de imagen en estudios de neurorregeneración al posicionar las neuronas regeneradas cerca del objetivo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Fabricación de almohadillas de agar canalizado utilizando moldes PDMS para controlar la orientación de los animales

<ol><li>Brenner, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+genetics+of+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">The genetics of Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 77 (1), 71-94 (1974).</li>
<li>Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Laser+killing+of+cells+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Laser killing of cells in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biol. 48, 225-250 (1995).</li>
<li>Zhang, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+self-regulating+feed-forward+circuit+controlling+C-elegans+egg-laying+behavior%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A self-regulating feed-forward circuit controlling C-elegans egg-laying behavior.</a> Curr Biol. 18 (19), 1445-1455 (2008).</li>
<li>Chung, S. H., Mazur, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Femtosecond+laser+ablation+of+neurons+in+C.+elegans+for+behavioral+studies%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Phys+A-Mater+Sci+Process%22%5BJournal%5D)">Femtosecond laser ablation of neurons in C. elegans for behavioral studies.</a> Appl Phys A-Mater Sci Process. 96 (2), 335-341 (2009).</li>
<li>Zellag, R. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CentTracker%3A+a+trainable%2C+machine-learning-based+tool+for+large-scale+analyses+of+Caenorhabditis+elegans+germline+stem+cell+mitosis%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">CentTracker: a trainable, machine-learning-based tool for large-scale analyses of Caenorhabditis elegans germline stem cell mitosis.</a> Mol Biol Cell. 32 (9), 915-930 (2021).</li>
<li>Huang, Y. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single+neuron+in+C.+elegans+orchestrates+multiple+motor+outputs+through+parallel+modes+of+transmission%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">A single neuron in C. elegans orchestrates multiple motor outputs through parallel modes of transmission.</a> Curr Biol. 33 (20), 4430-4445.e6 (2023).</li>
<li>Rasmussen, N. R., Dickinson, D. J., Reiner, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Ras-dependent+cell+fate+decisions+are+reinforced+by+the+RAP-1+small+GTPase+in+Caenorhabditis+elegans%5BTitle%5D)+AND+%22Genetics%22%5BJournal%5D)">Ras-dependent cell fate decisions are reinforced by the RAP-1 small GTPase in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 210 (4), 1339-1354 (2018).</li>
<li>Rivera Gomez, K., Schvarzstein, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Immobilization+of+nematodes+for+live+imaging+using+an+agarose+pad+produced+with+a+vinyl+record%5BTitle%5D)+AND+%22MicroPubl+Biol%22%5BJournal%5D)">Immobilization of nematodes for live imaging using an agarose pad produced with a vinyl record.</a> MicroPubl Biol. 2018, (2018).</li>
<li>Chung, S. H., Clark, D. A., Gabel, C. V., Mazur, E., Samuel, A. D. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+role+of+the+AFD+neuron+in+C.+elegans+thermotaxis+analyzed+using+femtosecond+laser+ablation%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Neuroscience%22%5BJournal%5D)">The role of the AFD neuron in C. elegans thermotaxis analyzed using femtosecond laser ablation.</a> BMC Neuroscience. 7 (1), 30(2006).</li>
<li>Gerhold Abigail, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigating+the+regulation+of+stem+and+progenitor+cell+mitotic+progression+by+in+situ+imaging%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">Investigating the regulation of stem and progenitor cell mitotic progression by in situ imaging.</a> Curr Biol. 25 (9), 1123-1134 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Matraz Erlenmeyer de 125 mL</td><td>Corning</td><td>4980-125</td><td></td></tr><tr><td>33 1/2 RPM o disco de vinilo de reproducción larga (LP) de 12 pulgadas;</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>Profundidad de canal individual: 50 &micro; m, ancho: 200 y micro; m</td></tr><tr><td>30 mL jeringa de plástico</td><td>Fisher Scientific</td><td>50-793-817</td><td></td></tr><tr><td>90% Platino, 10% Alambre de Iridio</td><td>Tritech Research&nbsp;</td><td>PT-9010</td><td>utilizado para crear</td>papel de aluminio de platino</tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Amazon</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>Cloruro de calcio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL131910B</td><td></td></tr><tr><td>panel de vidrio</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td>7 pulgadas x 5 en panel de vidrio tomado del marco&nbsp;</td></tr><tr><td>pipeta de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>13-678-20A</td> utilizada para crear una placa caliente de <td>púa de platino</td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Thermofisher</td><td></td> Sulfato de magnesio SP88857104 <td></td></tr><tr><td></td><td>Fisher Scientific</td><td>AA3333736</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de microscopio&nbsp;</td><td>Mckesson</td><td>938360</td><td></td></tr><tr><td>agar de grado de biología molecular&nbsp;</td><td>Benchmark Scientific</td><td>A1705</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio dibásico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P290-500</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potasio monobásico&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>P285-500</td><td></td></tr><tr><td>Azida de sodio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAJ2161022</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>cubreobjetos cuadrados</td><td>Fisher Scientific</td><td>12-541-016</td><td></td></tr><tr><td>SYLCAP 284-F (curado rápido) Kit de encapsulante de elastómero de silicona, transparente, ópticamente transparente, mezcla 10:1, 500 gm/ml (0,5 kg), más rápido que Sylgard 184 y similares&nbsp;</td>Desecador de vacío <td>MicroLubrol</td><td>N/A</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td>Plato de pesaje <td>Fisher Scientific</td><td>08-648-100</td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-549-750</td><td></td></tr></tbody></table>

ajuste fino de la orientación de caenorhabditis elegans en almohadillas de agar canalizadas para la neurorregeneración de imágenes

Fine Adjustment of Caenorhabditis elegans Orientation on Channeled Agar Pads for Imaging Neuroregeneration

Fabricación de moldes PDMS El ciclo de la presión de vacío durante la fabricación del molde perfora y elimina las burbujas de aire del PDMS sin curar, lo que garantiza un molde sin burbujas. Como se muestra en la Figura 3D , las burbujas suben a la superficie y perforan. Los moldes sin burbujas pueden producir canales limpios.
Solidificación del molde PDMS Al colocar el panel de vidrio sobre el disco de vinilo, evite crear espacios de aire. Estos espacios pueden dar lugar a un grosor desigual o defectos en la superficie. Las burbujas, si están presentes, se pueden detectar visualmente. Al presionar el panel de vidrio de un lado a otro, se desplaza el aire, lo que minimiza la formación de burbujas y garantiza un grosor de molde uniforme que se muestra en la Figura 4A.
Uso de almohadillas de agar canalizadas para la orientación fina de C. elegans Las almohadillas de agar canalizadas permiten una orientación precisa de C. elegans. Establecemos la orientación del animal enrollándolo ligeramente con una púa de alambre de platino, mientras verificamos la orientación utilizando puntos de referencia, como la vulva o el intestino en forma de S (Figura 5A, C). Confirmamos la orientación bajo un microscopio de disección fluorescente antes de transferir animales a un microscopio invertido que se muestra en la Figura 5B,D.
Evaluación de la regeneración de fibras neuronales con almohadillas de agar canalizadas Las almohadillas de agar canalizado mejoran la calidad de la imagen de la regeneración neuronal al orientar de forma óptima al animal. La colocación de las fibras neuronales regeneradas más cerca de la lente del objetivo reduce la dispersión y absorción de la luz, lo que mejora la claridad de la imagen. La figura 5E, F muestra que colocar el sitio de regeneración más cerca del objetivo mejora la calidad de la imagen, lo que facilita un análisis más preciso del recrecimiento neuronal.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig01.jpg"> 
Figura 1: Caenorhabditis elegans en almohadillas planas y acanaladas. (A) Animal en una almohadilla de agar plana en orientación DV; Cubreobjetos de la cara de la vulva. (B) La introducción del cubreobjetos empuja la vulva hacia un lado, forzando al animal a orientarse lateralmente. (C) Animal en almohadilla de agar canalizada en orientación DV. (D) El animal permanece en orientación DV después de la introducción del cubreobjetos. (E) Imagen de campo claro de un rodillo mutante en una almohadilla de agar canalizada en orientación DV. (F) Imagen de campo claro con cubreobjetos, el mismo animal que E permanece en orientación DV. Abreviaturas: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig02.jpg"> 
Figura 2: Materiales y equipos para la fabricación de PDMS. (A) Kit de elastómero de silicona SYLCAP 284-F. b) Escala. (C) Jeringa de plástico. (D) Desecador de vacío. (E) Placa calefactora. (F) Disco de vinilo de larga duración de 12 pulgadas, separar según sea necesario. (G) Vidrio de vidrio. Abreviatura: PDMS = polidimetilsiloxano. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig03.jpg"> 
Figura 3: Mezcla y aspiración de PDMS sin curar. (A) Mezcle la base y el agente de curado en la bandeja. (B) Coloque la bandeja en una cámara de vacío. (C) Realice el ciclo de vacío tres veces para permitir que las burbujas salgan a la superficie. (D) Después de una hora, la mayoría de las burbujas explotaron. Obsérvese la mejora de la transmisión a través de PDMS. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig04.jpg"> 
Figura 4: Introducción de un panel de vidrio a PDMS sin curar sin burbujas. (A) Introducción de un panel de vidrio en el disco de vinilo sin burbujas. (B) Molde de PDMS solidificado retirado del registro, con canales de detalle insertados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67811/67811fig05.jpg"> 
Figura 5: Imágenes de campo claro y fluorescencia de C. elegans montadas en agar canalizado. (A) Imagen de campo claro de un animal en orientación DV bilateral. Punto de referencia anatómico para la orientación DV: intestino espiral en forma de S (tejido más oscuro indicado por una flecha) que cruza la línea media ~ 60% de la distancia desde la nariz hasta la cola. (B) Imagen de fluorescencia de neuronas en orientación DV, el mismo animal que A. (C) Imagen de campo claro de un animal en orientación dorsal. Punto de referencia anatómico para la orientación dorsal: lado orientado hacia la vulva. (D) Imagen de fluorescencia de neuronas en orientación dorsal, del mismo animal que C. (E) Orientación con regeneración (flecha) en el lado más profundo (lejano) de un animal. (F) Orientación con regeneración en animales laterales menos profundos más cercanos al objetivo; Regeneración más clara (flecha). Barras de escala = 20 μm. Abreviaturas: DV = dorsal-ventral; lat = lateral. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67811/67811fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Ajuste fino de la orientación de Caenorhabditis elegans en almohadillas de agar canalizadas para la neurorregeneración de imágenes

Caenorhabditis elegans is a model organism widely used for studying biological processes. Its transparency and small size make it ideal for imaging ...

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