Ajuste fino de la orientación de Caenorhabditis elegans en almohadillas de agar canalizadas para la neurorregeneración de imágenes

El objetivo principal de nuestro laboratorio es definir los mecanismos subyacentes a la regeneración del sistema nervioso central de los mamíferos utilizando el organismo modelo, C. elegans. Estudiamos la regeneración a través de múltiples neuronas y buscamos la identidad de la señal de precondicionamiento que conduce a una mejor regeneración del sistema nervioso central. Los desafíos experimentales actuales incluyen la introducción de burbujas de aire mientras se reemplaza la placa de vidrio en el disco de vinilo y se obtiene un grosor de molde uniforme.

Sin embargo, una vez que se crea el molde PDMS, se puede reutilizar para las mordazas. La brecha de investigación que estamos abordando es el control limitado sobre la orientación de los animales adultos. Los animales adultos tienen un diámetro más grande y están más pigmentados, lo que causa problemas para obtener imágenes en planos Z más profundos.

Además, la introducción del cubreobjetos también cambia la orientación inicial. Los canales ayudan a mantener la orientación de los animales tras la introducción de la cubierta deslizante, lo que permite que las células objetivo estén más cerca del objetivo para la obtención de imágenes. Los canales también reducen el estrés en los animales, promoviendo una fisiología normal, fomentando la configuración lineal de los animales y creando consistencia al obtener imágenes entre varios animales.

Para comenzar, vierta una proporción de uno a 10 del agente de curado rápido en la base en un plato de pesaje desechable. Mezcle bien el líquido sin curar durante 45 segundos hasta que esté completamente integrado y lleno de burbujas. A continuación, coloque la bandeja que contiene la mezcla de PDMS sin curar en un desecador al vacío inclinado.

Cicle la presión entre menos 0,09 kilo de pascales y menos 0,1 kilo de pascales tres veces para permitir que las burbujas de aire salgan a la superficie. Enjuague bien el disco de vinilo y la placa de vidrio con agua desionizada y deje que el disco de vinilo se seque completamente al aire antes de usarlo más. Coloque una hoja de papel de aluminio encima de la placa calefactora para atrapar el exceso de PDMS.

A continuación, coloque una corredera de vidrio en cada extremo del disco de vinilo para establecer el grosor del molde, asegurando una altura uniforme al presionar el panel de vidrio sobre el PDMS sin curar. Ahora, vierte el líquido PDMS sin curar en un lado del disco de vinilo. Incline la placa de vidrio y bájela lentamente para permitir que escape el aire atrapado.

A continuación, cure el PDMS a 100 grados centígrados durante 20 minutos. Retira el disco de vinilo de la placa calefactora y deja que se enfríe. Después de eso, despegue con cuidado los PDMS del disco de vinilo para evitar que se rompan.

A continuación, retire el PDMS del cristal. Usando un nuevo portaobjetos de vidrio como guía, corte el PDMS con una navaja afilada para crear un molde de agar canalizado. Pelar el exceso de PDMS para mostrar el molde de agar canalizado de corte final.

Agregue 0,6 gramos de agar y 30 mililitros de caldo líquido de medio de crecimiento de nematodos en un matraz. Coloque una barra revolviendo en el matraz y caliente la mezcla en una placa caliente, ajustada a 120 grados centígrados. Agregue 120 microlitros de solución madre de azida de sodio después de que el gel se haya derretido.

A continuación, lave bien el molde de PDMS con agua y déjelo secar al aire. Coloque el molde PDMS entre dos juegos de pares de portaobjetos para prepararlo para su uso. Con una pipeta, extraiga la solución de agar hacia arriba y hacia abajo para calentar la punta de la pipeta y pipetear 300 microlitros de agar derretido en el molde de PDMS.

Finalmente, coloque un portaobjetos de microscopio directamente sobre el agar, asegurándose de que descanse sobre los portaobjetos de los lados. Retire el portaobjetos después de que el agar se haya enfriado por completo. Las almohadillas de agar canalizadas facilitaron la orientación precisa de Caenorhabditis elegans al hacer rodar el animal para alinear puntos de referencia, como la vulva y el intestino en forma de S, verificados bajo un microscopio de disección fluorescente antes de transferirlo a un microscopio invertido.

Las imágenes fluorescentes verificaron la orientación correcta de Caenorhabditis elegans en las almohadillas de agar canalizadas, como se muestra en las micrografías fluorescentes. Las almohadillas de agar canalizado mejoraron la calidad de la imagen para la regeneración neuronal al colocar las fibras neuronales regeneradas más cerca de la lente del objetivo, minimizando la dispersión y absorción de la luz.