Protocolo de inyección directa del nervio vago para ratas

Realizamos estudios preclínicos en terapia de reemplazo génico. Utilizamos animales de laboratorio para establecer el método óptimo de administración de fármacos para abordar problemas de sistemas nerviosos autónomos y periféricos. La terapia de reemplazo génico basada en vectores es una de las tecnologías emergentes en terapia génica. La aplicación del vector viral asociado a adino es una de las opciones potenciales disponibles ahora. AAV9 se ha utilizado ampliamente en la investigación de terapia génica para administrar el gen de interés en el sistema nervioso central y periférico. Los investigadores no tienen suficientes opciones disponibles para administrar agentes farmacológicos directamente en el sistema nervioso periférico. Hay situaciones que involucran trastornos neurológicos causados por el sistema nervioso periférico o autónomo. Sin embargo, falta un método eficaz de administración de medicamentos para abordar esas situaciones.

Este método demuestra una forma de administrar los agentes farmacológicos directamente en los nervios vagos para abordar el problema del sistema nervioso autónomo en estudios preclínicos con ratas. Además, este método se puede exportar para administrar medicamentos a través de otros nervios periféricos con las modificaciones necesarias en otras especies. El laboratorio gris continuará la investigación de terapia génica preclínica mediada por AV utilizando roedores y animales grandes. Además, nos enfocamos en desarrollar nuevos métodos aplicables para allanar la estrategia de terapia de reemplazo génico.

[Narrador] Para comenzar, conecte una jeringa de vidrio de 100 microlitros con el émbolo retirado a una aguja de calibre 27. Conecte un extremo de aproximadamente 45 centímetros de tubo de polietileno esterilizado a la aguja de calibre 27, luego coloque una jeringa de plástico de tres mililitros con una aguja de calibre 27 y cargue la jeringa con aproximadamente 0,5 mililitros de solución salina normal al 0,9%. Use la solución salina normal al 0,9% para llenar el tubo de polietileno desde el extremo abierto, asegurando que toda la longitud del tubo y el cilindro de la jeringa de vidrio estén llenos hasta que la solución salina se desborde. Una vez hecho esto, retire y deseche la jeringa de tres mililitros y su aguja. Ahora inserte el émbolo en el cilindro de la jeringa de vidrio, empújelo ligeramente hacia el centro del cilindro y coloque la jeringa de vidrio en la bomba de la jeringa. Use la bomba de jeringa para tirar del émbolo ligeramente hacia atrás, creando un espacio de aire de aproximadamente 1,5 centímetros en el extremo abierto del tubo. Pipetee al menos cinco microlitros de tinte y mezcla de fármacos candidatos con una micropipeta de 10 microlitros en un trozo de película para esterilizado. Retire la mezcla de fármacos candidatos en el tubo con la ayuda de la bomba de jeringa y marque el nivel de la mezcla de inyección con un marcador. Coloque una aguja de calibre 35 en el tubo y asegúrela a una superficie limpia en la etapa quirúrgica con cinta adhesiva, asegurándose de que permanezca fija, esterilizada y no toque nada más. Encienda la bomba de jeringa durante 10 a 15 segundos hasta que la solución inyectable comience a emerger de la punta de la aguja. Transfiera la rata anestesiada a una mesa equipada para la depilación y la preparación del sitio. Aplique ungüento lagrimeador artificial en ambos ojos de la rata para evitar la sequedad excesiva. Administrar analgésicos de acuerdo con el protocolo institucional aprobado en animales para controlar el dolor cuando la rata recupere la conciencia. Afeitado el lado ventral del cuello en la región cervical y extiéndalo hasta aproximadamente dos centímetros perpendicularmente desde la línea media en ambos lados desde la barbilla hasta el esternón. Esterilizar el área afeitada tres veces con alcohol etílico al 70% y Betadine al 10%, limpiando hacia afuera en un patrón circular. Transfiera la rata a la etapa quirúrgica en posición supina bajo el microscopio de disección. Asegúrese de que la almohadilla térmica debajo de la rata esté templada adecuadamente y ajuste los microscopios enfocados para visualizar la región cervical para la cirugía. Enganche las ratas o los dientes de la mandíbula con una sutura no absorbible. Fije el extremo abierto de la sutura dentro del cono de la nariz para mantener las fosas nasales dentro del cono de la nariz durante la anestesia. Coloque la rata de modo que su cabeza descanse sobre el lado izquierdo del cirujano diestro. Coloque un cojín de gasa esterilizado debajo del cuello para alinearlo y enderece la región cervical. Cubra el cuerpo de la rata con un paño esterilizado dejando el área quirúrgica expuesta. Fije cuatro pasadores retractores con fijadores magnéticos en las cuatro esquinas de la etapa quirúrgica. Ahora, inyecte anestésicos locales epidérmicos en la línea media de la región cervical donde se realizará la incisión. Use una hoja de bisturí para hacer una incisión cutánea longitudinal de dos centímetros en la línea media entre el mentón y el esternón en la región cervical ventral. Luego, con puntas de algodón esterilizadas, el romo separa los bordes de la piel cortada. Con las puntas del retractor, retraiga los bordes separados de la piel en direcciones opuestas. Separe la fascia con puntas de algodón para profundizar y empuje las glándulas salivales lateralmente. Ahora, separe los músculos mastoides del esternón con puntas de algodón y retírelos lateralmente con pasadores retractores. Continúe separando el tejido en el lado izquierdo de la tráquea hasta que la vaina carotídea sea visible. Use fórceps finos para crear un pequeño orificio en la vaina carótida sin dañar la arteria carótida y separe con cuidado el nervio vago izquierdo de la arteria carótida común. Una vez que el nervio se separa de la arteria con fórceps, use una aguja curva de calibre 25 colocada en una jeringa de un mililitro para enganchar y sostenga el nervio con la mano no dominante. Sostenga la aguja cargada con la mezcla de colorante candidato con la mano dominante. Para facilitar un pinchazo suave, mantenga el nervio recto tirando suavemente de él con el gancho de calibre 25. inserte la aguja en el nervio y avance más de 0,5 centímetros hacia adelante mientras mantiene la aguja paralela al nervio vago. Tire ligeramente hacia atrás para que aproximadamente de 0,4 a 0,5 centímetros de la aguja permanezcan dentro del nervio. Limite el número de pinchazos nerviosos con una sola aguja a no más de tres veces. Después de confirmar la inserción de la aguja, mantenga su posición sin movimiento y encienda la bomba de jeringa. Controle la infusión para asegurarse de que permanezca dentro del nervio y fluya sin problemas. Use el punto marcado en el tubo de infusión para rastrear el movimiento de la mezcla de tinte farmacológico. Observe cómo el nervio comienza a desarrollar el color del tinte. Retire la aguja curva de calibre 25 y, con puntas de algodón estériles, mueva suavemente los pañuelos a su posición original. Luego retire las puntas del retractor. Cierre la herida con una sutura absorbible o no absorbible y aplique una pequeña cantidad de pegamento de tejido entre los puntos si es necesario para asegurarse de que la herida se cierre perfectamente.