Análisis del flujo metabólico ex vivo en macrófagos esplénicos y cardíacos y monocitos de médula ósea

Aquí, describimos en detalle los métodos para extraer macrófagos de la médula ósea, el bazo y el corazón infartado, y posteriormente evaluar el flujo metabólico en células vivas.

Nuestra investigación se centra en el papel del inmunometabolismo durante el infarto de miocardio. Queremos entender cómo los cambios en el metabolismo de las células inmunitarias regulan su fenotipo durante la lesión cardíaca y la inflamación.

Combinamos los enfoques genéticos in vivo con la extracción celular de precisión, el fenotipado celular, el fenotipado metabólico, la transcriptómica y la metabolómica para comprender mejor el impacto del metabolismo de los macrófagos en la remodelación cardíaca.

Este protocolo nos permite comprender cómo cambia el metabolismo de los macrófagos después del infarto de miocardio, bajo diferentes condiciones de enfermedad como la obesidad o la diabetes, y cómo las diferentes terapias afectan el metabolismo de los macrófagos.

Esta técnica permite un análisis rápido de macrófagos vivos recién extraídos, evitando así el cultivo a largo plazo. También permite la evaluación simultánea de otros cambios fenotípicos en las mismas células.

Este protocolo nos permitirá a nosotros y a otros comprender mejor el metabolismo de los macrófagos en diferentes estados inflamatorios o autoinmunes. También podría modificarse para estudiar otros subtipos inmunológicos.

[Narrador] Para comenzar, obtenga los huesos de las patas del ratón experimental y corte con cuidado ambos extremos del hueso. Con una jeringa de 10 mililitros con una aguja de calibre 27, enjuague la médula ósea en un tubo cónico de 15 mililitros que contenga tampón PEB. Centrifugar la suspensión a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Genere una suspensión de una sola célula y lisar los glóbulos rojos. Luego agregue tampón PEB, seguido de un reactivo bloqueador del receptor Fc y un cóctel de anticuerpos de biotina de monocitos a cinco veces 10 a la potencia de siete células totales. Incube la mezcla en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Lave las células con 10 mililitros de tampón PEB y centrifugue la suspensión a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. A continuación, recoja el gránulo celular y vuelva a suspenderlo en 500 microlitros de tampón PEB y 100 microlitros de microperlas antibiotina. Incube la mezcla en la oscuridad a cuatro grados centígrados durante 10 minutos. Ahora, prepare una columna magnética en un soporte con un mililitro de tampón PEB. Aplique inmediatamente la suspensión celular a la columna y recoja el flujo a través de los monocitos que contienen en un tubo de 15 mililitros. Después de lavar la columna dos veces con un mililitro de tampón PEB, cuente los monocitos en el flujo con un hemocitómetro. Para preparar los monocitos para el siguiente paso, centrítelos a 300 G durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Para el análisis de flujo, vuelva a suspender el sedimento celular en un mililitro de RPMI con FBS al 0,1%. Mantenga las células restantes en PEB frío para citometría de flujo y proceda con la tinción. Un día antes del ensayo, retire el cartucho del sensor de su embalaje. Separe la placa del sensor verde de los pocillos y pipetee 200 microlitros de fluido calibrante en cada pocillo. Vuelva a colocar la placa del sensor en la placa del cartucho para que los sensores se sumerjan en el líquido calibrante. Coloque el cartucho en una incubadora humidificada sin dióxido de carbono a 37 grados Celsius durante la noche. Luego, coloque las células junto con 200 microlitros de medio en una placa de cultivo de 96 pocillos durante al menos una hora. Prepare los medios de flujo metabólico para el ensayo. Use RPMI basal o DMEM sin glucosa, glutamina o piruvato, y complemente los medios de acuerdo con la prueba específica. Reemplace con cuidado el medio viejo en los pocillos con el medio basal recién preparado y revise las células bajo un microscopio para confirmar su integridad. Coloque la placa celular en una incubadora humidificada sin dióxido de carbono a 37 grados centígrados. Ahora recupere la placa de flujo del cartucho sensor hidratado de la incubadora y prepare los compuestos de prueba para la glucólisis o las pruebas de estrés mitocondrial. Cargue volúmenes apropiados de compuestos de prueba en los puertos de la placa de fundente. Ahora abra el software y seleccione Prueba de esfuerzo mitocondrial. Seleccione los pocillos que se utilizarán, asegurándose de que al menos un pocillo esté en blanco para las mediciones de fondo. Para ejecutar el programa, cargue la placa de fundente sin su tapa para la calibración, lo que demora aproximadamente 20 minutos. Después de la calibración, retire la parte inferior de la placa de fundente y coloque la placa de celda en el soporte. Presione Ejecutar para iniciar el ensayo, que tardará aproximadamente 2,5 horas. Analice los resultados utilizando software de flujo metabólico u otras herramientas analíticas. La médula ósea de dos tibias y dos fémures produjo una buena cantidad de monocitos. La citometría de flujo ilustró la heterogeneidad de macrófagos cardíacos y esplénicos para Ly6C, mientras que los monocitos de médula ósea fueron altamente positivos para Ly6C. Los cambios en la tasa de acidificación extracelular y la tasa de consumo de oxígeno se mostraron como injertos de línea. El ayuno en ratones condujo a una disminución de la glucólisis y un aumento de la relación OCR por ECAR en monocitos de médula ósea, como se observó en las pruebas de esfuerzo mitocondrial y glucólisis.