Método novedoso y eficiente para la tinción de fluorescencia cardíaca de Drosophila con criosección

Mi laboratorio de investigación utiliza el modelo de Drosophila para estudiar el envejecimiento y los trastornos metabólicos, explorando la alimentación restringida en el tiempo y el ejercicio como intervención para las enfermedades metabólicas, cardíacas, del sueño y otras enfermedades del envejecimiento. El aprendizaje automático y la ómica con estrategia fisiológica, genética y nutricional están optimizando el ensayo de Drosophila utilizando dispositivos impresos en 3D y enfoques de aprendizaje automático. La inmunohistoquímica fluorescente de los corazones de Drosophila permite la detección de múltiples proteínas en todos los genotipos y edades, pero se enfrenta a desafíos como disecciones complejas, preservación de tejidos e imágenes de alta resolución de patrones de expresión de proteínas específicas.

Este protocolo mejora la preservación de tejidos, la penetración de anticuerpos y la resolución de las imágenes, lo que permite una mejor visualización de los marcadores de proteínas cardíacas. Aborda desafíos como la disección compleja, el daño tisular y la resolución limitada en el método tradicional de montaje de corazón entero. Este protocolo mejora la accesibilidad a la investigación del corazón de Drosophila al eliminar la disección compleja, permitir la ejecución con una sola mano y evitar la costosa microscopía confocal, lo que hace que las imágenes de alta resolución sean más factibles.

Para comenzar, anestesia de 5 a 10 moscas con una colchoneta de dióxido de carbono y coloca las moscas a la vista bajo el microscopio con un aumento de 1X a 2X. Con unas tijeras de resorte, decapita las moscas, corta las alas y quita las patas.

Mantenga el tórax y el abdomen juntos, lo que se conoce como el cuerpo. Con un cepillo, coloque suavemente los cuerpos en tubos etiquetados de 1,5 mililitros sobre hielo hasta que se hayan recogido todos los grupos experimentales. Después de retirar los tubos del hielo, agregue 100 microlitros de ácido etilenglicol tetraacético de 10 milimolares a pH 8 a cada tubo.

Asegúrese de que todos los cuerpos estén sumergidos y coloque los tubos en un agitador orbital durante 10 minutos. Luego, retire y deseche la solución de ácido etilenglicol tetraacético de los tubos. Pipetee 100 microlitros de PBS en cada tubo para lavar el pañuelo durante 10 minutos.

Coloque los tubos en el agitador orbital durante el proceso de lavado. Después de desechar el PBS, pipetee 100 microlitros de paraformaldehído al 4% en solución de PBS en cada tubo. Coloque los tubos en un agitador orbital a 100 unidades durante 15 minutos, asegurándose de que los tejidos permanezcan en contacto con la solución.

Luego, desecha la solución de paraformaldehído. Una vez finalizado el lavado final, transfiera los cuerpos a una solución de sacarosa al 10% en PBS. Asegúrese de que los cuerpos estén en contacto con la solución dentro del tubo.

Recupere el hielo seco del almacenamiento y seleccione algunas piezas para colocarlas en una pequeña bandeja de metal o plástico. Elija una bandeja con dimensiones que permitan insertar el molde y colóquela directamente encima de una sola pieza grande y plana de hielo seco. Llene un molde etiquetado hasta el 50% con una temperatura de corte óptima, o compuesto OCT, vertiendo lentamente para minimizar las burbujas.

Con un cepillo, coloque cuidadosamente los cuerpos de Drosophila disecados y fijados en la superficie del compuesto OCT dentro del molde. Con pinzas, empuje cada cuerpo hasta el fondo del molde con la pared dorsal del tórax y el abdomen generalmente alineados a lo largo de la parte inferior. Ajuste los cuerpos de tal manera que el abdomen quede plano a lo largo de la parte inferior del molde.

Alinee todos los cuerpos en las dimensiones X, Y y Z para asegurarse de que cada sección incluya todos los sujetos simultáneamente. Corregir la curvatura del abdomen, especialmente en los hombres, para aplanarlo lo más posible sin perforar ni aplastar los cuerpos. Una vez que todos los sujetos estén en su lugar, coloque el molde de modo que la parte inferior se asiente directamente sobre un trozo de hielo seco.

Asegúrese de que el compuesto OCT comience a congelarse al contacto y continúe hasta que todos los sujetos estén completamente encerrados en el molde. Después de congelar, transfiera el molde a un congelador configurado a menos 20 grados centígrados para permitir la congelación completa en todo momento. Una vez que esté completamente congelado, llene la porción restante del molde con compuesto OCT.

Para fijar una broca de mandril al molde, aplique una cantidad generosa de compuesto OCT al bloque. Presione la broca sobre el compuesto y deje que se congele completamente en el criostato, generalmente dentro de los cinco minutos. A continuación, suelte la broca del mandril y el bloque OCT del molde.

Coloque la broca en el portabrisas, asegurándose de que el bloque permanezca correctamente orientado de arriba a abajo y apriete la llave del mandril para asegurar la broca. Ahora, usando las perillas de ajuste y los controles de profundidad del mandril, alinee el bloque con la hoja y establezca el ancho de la sección en 20 micrómetros o menos. Corte cada rebanada del bloque con un movimiento lento pero constante, permitiendo que el vidrio estabilizador capture cada rebanada a medida que se corta.

Recoja las secciones usando portaobjetos calentados. Con una cuchilla de afeitar, retire el exceso de compuesto OCT que rodea las secciones. Delinea el borde de cada portaobjetos con un marcador hidrofóbico para mantener las soluciones de lavado y tinción confinadas al tejido.

Con una pipeta de 1000 microlitros, lave los portaobjetos tres veces con PBS durante cinco minutos cada uno sin tocar el tejido. Después de desechar el lavado final, pipetee la solución de tinción fluorescente en los pañuelos e incube durante una hora a temperatura ambiente en la oscuridad. Luego, deseche la mancha fluorescente y lave los portaobjetos tres veces durante cinco minutos cada uno con PBS.

Luego, deseche el lavado final de PBS, dejando una pequeña cantidad de solución en el portaobjetos. Con una pipeta de 1000 microlitros, pipetee de tres a cinco gotas de medio de montaje en el portaobjetos, evitando la aplicación directa al tejido. Con unas pinzas, coloque el cubreobjetos en un borde y baje gradualmente el otro lado hasta que quede al ras del portaobjetos.

Sella los portaobjetos con esmalte de uñas sin neón ni purpurina. Si el medio de montaje no se endurece, dependiendo de la mancha fluorescente, tome una imagen inmediatamente o guarde los portaobjetos para más tarde. Antes de tomar imágenes, inspeccione los portaobjetos para ver si están limpios y límpielos suavemente con una toallita de papel con una solución de etanol al 70% en agua.

Analice los sujetos fluorescentes más brillantes dentro del experimento para seleccionar los tiempos de exposición apropiados para cada canal de fluorescencia. Encuesta a cada grupo experimental en una vista en vivo de todos los canales para confirmar los ajustes de exposición correctos. Para mantener la coherencia, concéntrese en cada sujeto utilizando el mismo canal de fluorescencia y capture imágenes para todos los sujetos.

Después de la toma de imágenes, guarde las diapositivas en la oscuridad a cuatro grados centígrados para volver a capturar imágenes en el futuro. El método de imagen de fluorescencia conservó las características clave del corazón de Drosophila, como los ostios, la válvula, las fibras longitudinales y las fibras circunferenciales. Toda la estructura del tubo cardíaco y las estructuras menores detalladas se capturaron con diferentes aumentos, con aumentos de 10X para toda la estructura y aumentos de 40X a 60X que muestran detalles más finos, como fibras contráctiles circunferenciales y fibras estabilizadoras longitudinales.

Las micrografías de fluorescencia representativas demostraron estructuras cardíacas preservadas en drosophila w1118 con núcleos teñidos con DAPI, lípidos teñidos de verde y miofibrillas que contienen actina teñidas de rojo con faloidina. La tinción con faloidina resaltó eficazmente las fibras longitudinales y circunferenciales, demostrando la estructura del filamento de actina preservada a pesar de las tensiones de congelación y sección. La tinción de manchas lipídicas reveló almacenamiento de grasa localizado cerca del tubo cardíaco.