Name: Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T14:50:00.000+00:00
Duration: 5 min 34 s
Description: Aprenda a aislar adipocitos maduros de ratones con diferentes condiciones dietéticas usando colagenasa y DNasa. Este protocolo escalable permite estudios funcionales ex vivo para investigar la obesidad y el metabolismo.

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<meta charset="utf8"></head><body>Cultivo de adipocitos y explantes murinos para estudios funcionales y de imagen

<ol><li>Ward, Z. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Projected+U.S.+state-level+prevalence+of+adult+obesity+and+severe+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22N+Engl+J+Med%22%5BJournal%5D)">Projected U.S. state-level prevalence of adult obesity and severe obesity.</a> N Engl J Med. 381 (25), 2440-2450 (2019).</li>
<li>Vishvanath, L., Gupta, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Contribution+of+adipogenesis+to+healthy+adipose+tissue+expansion+in+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22J+Clin+Invest%22%5BJournal%5D)">Contribution of adipogenesis to healthy adipose tissue expansion in obesity.</a> J Clin Invest. 129 (10), 4022-4031 (2019).</li>
<li>Longo, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+dysfunction+as+determinant+of+obesity-associated+metabolic+complications%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Sci%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue dysfunction as determinant of obesity-associated metabolic complications.</a> Int J Mol Sci. 20 (9), 2358(2019).</li>
<li>Funcke, J. B., Scherer, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Beyond+adiponectin+and+leptin%3A+Adipose+tissue-derived+mediators+of+inter-organ+communication%5BTitle%5D)+AND+%22J+Lipid+Res%22%5BJournal%5D)">Beyond adiponectin and leptin: Adipose tissue-derived mediators of inter-organ communication.</a> J Lipid Res. 60 (10), 1648-1684 (2019).</li>
<li>Johnston, E. K., Abbott, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+paracrine-%2C+autocrine-%2C+and+matrix-dependent+signaling+during+the+development+and+progression+of+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue paracrine-, autocrine-, and matrix-dependent signaling during the development and progression of obesity.</a> Cells. 12 (3), 407(2023).</li>
<li>Koenen, M., Hill, M. A., Cohen, P., Sowers, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Obesity%2C+adipose+tissue+and+vascular+dysfunction%5BTitle%5D)+AND+%22Circ+Res%22%5BJournal%5D)">Obesity, adipose tissue and vascular dysfunction.</a> Circ Res. 128 (7), 951-968 (2021).</li>
<li>Liu, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptomic+and+lipidomic+profiling+of+subcutaneous+and+visceral+adipose+tissues+in+15+vertebrates%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Data%22%5BJournal%5D)">Transcriptomic and lipidomic profiling of subcutaneous and visceral adipose tissues in 15 vertebrates.</a> Sci Data. 10 (1), 453(2023).</li>
<li>Wu, Y., Li, X., Li, Q., Cheng, C., Zheng, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue-to-breast+cancer+crosstalk%3A+Comprehensive+insights%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta+Rev+Cancer%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue-to-breast cancer crosstalk: Comprehensive insights.</a> Biochim Biophys Acta Rev Cancer. 1877 (5), 188800(2022).</li>
<li>Emont, M. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+single-cell+atlas+of+human+and+mouse+white+adipose+tissue%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">A single-cell atlas of human and mouse white adipose tissue.</a> Nature. 603 (7903), 926-933 (2022).</li>
<li>Nahmgoong, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Distinct+properties+of+adipose+stem+cell+subpopulations+determine+fat+depot-specific+characteristics%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Distinct properties of adipose stem cell subpopulations determine fat depot-specific characteristics.</a> Cell Metab. 34 (3), 458-472.e6 (2022).</li>
<li>Hildreth, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+sequencing+of+human+white+adipose+tissue+identifies+new+cell+states+in+health+and+obesity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Immunol%22%5BJournal%5D)">Single-cell sequencing of human white adipose tissue identifies new cell states in health and obesity.</a> Nat Immunol. 22 (5), 639-653 (2021).</li>
<li>Maniyadath, B., Zhang, Q., Gupta, R. K., Mandrup, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipose+tissue+at+single-cell+resolution%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Metab%22%5BJournal%5D)">Adipose tissue at single-cell resolution.</a> Cell Metab. 35 (3), 386-413 (2023).</li>
<li>Gao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Adipocytes+promote+breast+tumorigenesis+through+taz-dependent+secretion+of+resistin%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Adipocytes promote breast tumorigenesis through taz-dependent secretion of resistin.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 117 (52), 33295-33304 (2020).</li>
<li>Cornide-Petronio, M. E., Jimenez-Castro, M. B., Gracia-Sancho, J., Peralta, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((New+insights+into+the+liver-visceral+adipose+axis+during+hepatic+resection+and+liver+transplantation%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">New insights into the liver-visceral adipose axis during hepatic resection and liver transplantation.</a> Cells. 8 (9), 1100(2019).</li>
<li>Verma, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Zinc-alpha-2-glycoprotein+secreted+by+triple-negative+breast+cancer+promotes+peritumoral+fibrosis%5BTitle%5D)+AND+%22Cancer+Res+Commun%22%5BJournal%5D)">Zinc-alpha-2-glycoprotein secreted by triple-negative breast cancer promotes peritumoral fibrosis.</a> Cancer Res Commun. 4 (7), 1655-1666 (2024).</li>
<li>Min, S. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+repertoire+of+human+adipocyte+subtypes+develops+from+transcriptionally+distinct+mesenchymal+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Diverse repertoire of human adipocyte subtypes develops from transcriptionally distinct mesenchymal progenitor cells.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 116 (36), 17970-17979 (2019).</li>
<li>Harms, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mature+human+white+adipocytes+cultured+under+membranes+maintain+identity%2C+function%2C+and+can+transdifferentiate+into+brown-like+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Mature human white adipocytes cultured under membranes maintain identity, function, and can transdifferentiate into brown-like adipocytes.</a> Cell Rep. 27 (1), 213-225.e5 (2019).</li>
<li>Chaurasiya, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+visceral+adipose+tissue+microvascular+endothelial+cell+isolation+and+establishment+of+co-culture+with+white+adipocytes+to+analyze+cell-cell+communication%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Human visceral adipose tissue microvascular endothelial cell isolation and establishment of co-culture with white adipocytes to analyze cell-cell communication.</a> Exp Cell Res. 433 (2), 113819(2023).</li>
<li>Galmozzi, A., Kok, B. P., Saez, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+differentiation+of+primary+white+and+brown+pre-adipocytes+from+newborn+mice%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and differentiation of primary white and brown pre-adipocytes from newborn mice.</a> J Vis Exp. 167, e62005(2021).</li>
<li>Farrar, J. S., Martin, R. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+of+the+stromal+vascular+fraction+from+adipose+tissue+and+subsequent+differentiation+into+white+or+beige+adipocytes%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isolation of the stromal vascular fraction from adipose tissue and subsequent differentiation into white or beige adipocytes.</a> Methods Mol Biol. 2455, 103-115 (2022).</li>
<li>You, X., Gao, J., Yao, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advanced+methods+to+mechanically+isolate+stromal+vascular+fraction%3A+A+concise+review%5BTitle%5D)+AND+%22Regen+Ther%22%5BJournal%5D)">Advanced methods to mechanically isolate stromal vascular fraction: A concise review.</a> Regen Ther. 27, 120-125 (2024).</li>
<li>Liu, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Progenitor+cell+isolation+from+mouse+epididymal+adipose+tissue+and+sequencing+library+construction%5BTitle%5D)+AND+%22STAR+Protoc%22%5BJournal%5D)">Progenitor cell isolation from mouse epididymal adipose tissue and sequencing library construction.</a> STAR Protoc. 4 (4), 102703(2023).</li>
<li>Cho, D. S., Doles, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Preparation+of+adipose+progenitor+cells+from+mouse+epididymal+adipose+tissues%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Preparation of adipose progenitor cells from mouse epididymal adipose tissues.</a> J Vis Exp. 162, e61694(2020).</li>
<li>Lauschke, V. M., Hagberg, C. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Next-generation+human+adipose+tissue+culture+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Genet+Dev%22%5BJournal%5D)">Next-generation human adipose tissue culture methods.</a> Curr Opin Genet Dev. 80, 102057(2023).</li>
<li>Alexandersson, I., Harms, M. J., Boucher, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+mature+adipocytes+using+membrane+mature+adipocyte+aggregate+cultures+%28MAAC%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human mature adipocytes using membrane mature adipocyte aggregate cultures (MAAC).</a> J Vis Exp. 156, e60485(2020).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>100x Poloxámero 188 solución</td><td>Sigma</td><td>P5556-100mL 15 mL</td><td></td></tr><tr><td>cónico</td><td>Cellstar</td><td>188261</td><td></td></tr><tr><td>21 G Aguja</td><td>BD 305165</td><td></td><td></td></tr><tr><td>5 mL Jeringa</td><td>BD 309646</td><td></td><td></td></tr><tr><td>50 mL Cónico</td><td>Cellstar</td><td>227261</td><td></td></tr><tr><td>6,5 mm Transwell con 0,4 y micro; m Inserto de membrana de policarbonato para poros</td><td>Corning</td><td>3413</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A7906-100G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl2</td><td>Sigma</td><td>C1016-500gm</td><td></td></tr><tr><td>CellMask Tinciones de membrana plasmática</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>C10045</td><td></td></tr><tr><td>CL 316243 sal disódica</td><td>Tocris</td><td>1499</td><td></td></tr><tr><td>Colagenasa en polvo</td><td>Sigma</td><td>C6885</td><td></td></tr><tr><td>DMEM</td><td>Gibco</td><td>11995-040</td><td></td></tr><tr><td>DMEM sin feonol rojo</td><td>Gibco</td><td>A14430-01</td><td></td></tr><tr><td>DNasa I</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10104159001</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino (FBS)</td><td>Gibco</td><td>A56708-01</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Tissue Path Superfrost Plus Gold Slides</td><td>Fisher scientific</td><td></td><td></td>1518848</tr><tr><td>Punta de pipeta de carga de gel</td><td>Fisher scientific</td><td>02-707-181</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>35050061</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensayo de glicerol</td><td>Abcam</td><td>AB133130</td><td></td></tr><tr><td>Hanks' Solución salina equilibrada (HBSS)</td><td>Gibco</td><td>14025-092</td><td></td></tr><tr><td>Tampón HEPES</td><td>Sigma</td><td>83264-100ml-F</td><td></td></tr><tr><td>Heraeus Centrífuga Megafuge 16R</td><td>Thermo Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>75004271</tr><tr><td>Hoechst 33342 Solución</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>62249</td><td></td></tr><tr><td>Mini agitador de incubación</td><td>VWR</td><td>12620-942</td><td></td></tr><tr><td>Medio 199</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M4530</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio</td><td>VWR</td><td>16004-302</td><td></td></tr><tr><td>PBS</td><td>Gibco</td><td>10010023</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>15140-122</td><td></td></tr><tr><td>Espaciadores de imagen SecureSeal</td><td>Grace Biolabs</td><td>654006</td><td></td></tr><tr><td>Seive (colador de cóctel de malla fina SteeL)</td><td>OXO</td><td>3112000</td><td>https://www.oxo.com/steel-fine-mesh-cocktail-strainer-660.html</td></tr></tbody></table>

aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Isolation and Culturing of Primary Murine Adipocytes from Lean and Obese Mice

Como se muestra en la Figura 2, la picadura adecuada (Figura 2B) y la digestión (Figura 2C) son importantes para el aislamiento de los adipocitos maduros intactos. La falta de picado y la digestión insuficientes pueden dar lugar a un bajo rendimiento de adipocitos maduros debido a una separación inadecuada del tejido conectivo. Visualmente, esto se puede observar con tejido fibroso que queda después de la picadura y grumos visibles en la solución de colagenasa. Además, el exceso de picado y digestión también da como resultado un bajo rendimiento debido al estallido de los adipocitos maduros. Visualmente, esto da como resultado la pérdida de la capa opaca blanca y una acumulación de una capa lipídica grande, clara y libre. Los niveles inadecuados de picado o digestión darán como resultado un aislamiento deficiente de los adipocitos.
La preparación y digestión adecuadas del tejido adiposo dará como resultado la separación del tejido en cuatro capas distintas, como se ve en la Figura 3. Es inevitable que se produzca un estallido de los adipocitos que dé lugar a la liberación de lípidos libres; Sin embargo, la picadura y la digestión adecuadas asegurarán una ruptura mínima de los adipocitos. El resto de la capa lipídica libre y los medios se eliminarán durante el empaquetamiento de los adipocitos (Figura 4). El empaquetamiento adecuado de los adipocitos es esencial para el aislamiento eficiente de los adipocitos maduros. Los lípidos o medios libres restantes darán lugar a un aislamiento deficiente y tendrán un impacto negativo en los ensayos funcionales posteriores, como la colocación de placas, la lipólisis y la obtención de imágenes celulares.
Este protocolo genera una preparación limpia de adipocitos maduros. Se pueden realizar pruebas de imagen celular y lipólisis para evaluar la función celular y demostrar que los adipocitos maduros conservan la función después del aislamiento y después del cultivo durante un máximo de dos semanas. El ensayo de lipólisis indica que los adipocitos maduros mantienen la capacidad de responder a la señalización celular a través de la liberación de glicerol libre tras la estimulación del receptor adrenérgico β-3 (Figura 6A,B). Esta capacidad se mantiene incluso después de 2 semanas en cultivo y es altamente comparable a la actividad de lipólisis de los explantes de tejido adiposo cultivados durante 24 h (Figura 6C,D). Los adipocitos de mala calidad mostrarán lipólisis atenuada. Las imágenes celulares de los adipocitos aislados muestran adipocitos maduros uniloculares redondos e intactos que contienen una sola gota de lípidos grande. Los aislamientos de adipocitos de mala calidad mostrarán principalmente grandes gotas de aceite extracelular indicativas de adipocitos reventados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig01.jpg"> 
Figura 1: Inclusión de explantes de tejido adiposo. (A) Imagen de la cúpula de la matriz de la membrana basal parcialmente solidificada antes de la inclusión del tejido. (B) Imágenes representativas de incrustación de tejido inadecuada y adecuada. La incrustación incorrecta es visible ya que el tejido parece flotar parcial o completamente por encima de la cúpula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig02.jpg"> 
Figura 2: Esquema de picado y digestión adecuados del tejido adiposo. (A) Representación esquemática de las etapas de picado y digestión de los tejidos 4.2-4.6. (B) Imágenes representativas de tejido subpicado, óptimo y sobrepicado. El tejido poco picado tiene trozos grandes que conservan su forma original. El tejido picado en exceso da como resultado un aumento visible de los lípidos libres que rodean el tejido, que parecen claros y aceitosos. (C) Imágenes representativas de tejido subdigerido, óptimo y sobredigerido. El tejido mal digerido contiene trozos de tejido entero que permanecen en la solución. El tejido sobredigerido exhibe una gran capa de lípidos libres que se separa rápidamente de la solución. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig03.jpg"> 
Figura 3: Separación de capas de tejido adiposo digerido. (A) Imagen esquemática y representativa de las capas que están presentes siguiendo el paso 5.3. (B) Uso de una punta de pipeta cortada para eliminar la capa de adipocitos maduros del tubo cónico de 50 mL. (C) Técnica y colocación adecuadas de la aguja y la jeringa para eliminar los medios de cultivo por debajo de la capa de adipocitos maduros. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig04.jpg"> 
Figura 4: Empaquetamiento secuencial de adipocitos maduros. Imágenes secuenciales del empaquetamiento de los adipocitos maduros. Se marcan capas de lípidos libres, adipocitos y medios. Después de cada centrifugado, se eliminan los lípidos y medios libres. Esto se repite hasta que no haya medios o lípidos libres que se separen de los adipocitos después de un centrifugado. La imagen final es representativa de adipocitos maduros bien empaquetados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig05.jpg"> 
Figura 5: Siembra y cultivo de adipocitos maduros. (A) Esquema de la siembra de adipocitos maduros. Con una punta de pipeta p200 cortada, los adipocitos empaquetados se colocan en la membrana de un inserto de cultivo celular. A continuación, el inserto se invierte en pocillos precargados de medios de cultivo. (B) Una imagen representativa de la placa de adipocitos maduros que representa la punta de la pipeta cortada depositando adipocitos en el inserto transwell. (C) Esquemas e imágenes representativas de adipocitos debidamente empaquetados y mal empaquetados sembrados con transpocillos, vistos desde arriba de los pocillos. Los adipocitos correctamente empaquetados aparecen blancos y opacos, mientras que los adipocitos mal empaquetados dan lugar a la formación de gotas lipídicas transparentes. (D) Esquema de la técnica utilizada para cambiar los medios de cultura. Se utiliza una punta de pipeta p200 para extraer cuidadosamente el medio a través de las aberturas de la pared lateral del inserto transwell. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67846/67846fig06.jpg"> 
Figura 6: Imagen de adipocitos maduros y ensayo de lipólisis. (A,B) Liberación de glicerol de los adipocitos maduros subcutáneos (A) y viscerales (B). Los adipocitos se aislaron de ratones machos C57BL/6 de 16 semanas de edad alimentados con una dieta normal de comida. Se sembraron 30 μL de adipocitos como se describe en el paso 7.1 y se cultivaron durante 1 o 10 días. Los adipocitos se trataron con 5 μM de CL-316,243 durante 1 h, 2 h y 4 h, y se recolectaron y analizaron sobrenadantes para glicerol libre. (C,D) Liberación de glicerol de explantes de tejido adiposo subcutáneo (C) y visceral (D). El tejido adiposo se aisló de ratones hembra C57BL/6 de 18 semanas de edad alimentados con una dieta normal de comida. Se sembraron 0,1 g de explantes de tejido adiposo como se describe en los pasos 3.1-3.4 y se cultivaron durante 24 h. Los adipocitos se trataron con 5 μM de CL-316,243 durante 1 h, 2 h y 4 h, y se recolectaron y analizaron sobrenadantes para glicerol libre. N = 3 réplicas técnicas para A-D. Todos los datos son media ± desviación estándar. (E) Imágenes representativas de adipocitos maduros subcutáneos y viscerales aislados. Los adipocitos se aislaron de ratones machos C57BL/6J de 16 semanas de edad alimentados con una dieta normal de comida. Los adipocitos se tiñeron con tinción de membrana plasmática (rojo) y tinción de núcleos de Hoechst (azul). Barras de escala: 50 μm; Aumento: 60x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67846/67846fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>Sexo</td>
			<td>Dieta</td>
			<td>Depósito</td>
			<td>Dificultad de picado</td>
			<td>Colagenasa: Proporción de tejidos</td>
			<td>Tiempo de digestión sugerido (min)</td>
			<td>Temperatura de centrifugado.</td>
			<td>Temperatura de lavado.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Hembra</td>
			<td rowspan="2">Comida normal</td>
			<td>Subcutáneo</td>
			<td>Duro</td>
			<td>2:1</td>
			<td>12</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Medio</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dieta alta en grasas</td>
			<td>Subcutáneo</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>8</td>
			<td>RT</td>
			<td>37 °C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="4">Masculino</td>
			<td rowspan="2">Comida normal</td>
			<td>Subcutáneo</td>
			<td>Duro</td>
			<td>2:1</td>
			<td>14</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Medio</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td rowspan="2">Dieta alta en grasas</td>
			<td>Subcutáneo</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Visceral</td>
			<td>Fácil</td>
			<td>1:1</td>
			<td>10</td>
			<td>4 °C</td>
			<td>RT</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabla 1: Sexo, depósito y modificaciones específicas de la dieta. La dificultad de picado de cada tejido, descrita como "Fácil", "Media" o "Dura" en relación con otros depósitos. Tenga en cuenta que el tiempo real de picado variará según el investigador y el tejido. Colagenasa: Proporción de tejido indicada como volumen (mL) de colagenasa + solución de DNasa preparada en el paso 4.1 con respecto al peso del tejido (g). El tiempo de digestión es una estimación aproximada, pero el tiempo de digestión real variará según la picadura y el tejido. Los investigadores deben evaluar la digestión como se describe en el protocolo. La temperatura de centrifugado y la temperatura de lavado difieren entre ratones machos y hembras. RT denota la temperatura ambiente.

Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Adipose tissue is primarily composed of mature, lipid-laden adipocytes by volume. These postmitotic cells play a critical role in energy storage and ...

Nuestra investigación se centra en investigar la función de los adipocitos maduros de diferentes depósitos de grasa y condiciones dietéticas. Estamos específicamente interesados en comprender cómo los adipocitos maduros se comunican con las células circundantes y cómo esta diafonía puede influir en la progresión de la enfermedad y alterarse en la obesidad. Los adipocitos maduros son células grandes y delicadas, lo que hace que los métodos de aislamiento celular comúnmente utilizados, como el FACS, sean ineficaces.Además, los altos niveles de lípidos libres que a menudo se encuentran en el tejido adiposo pueden ser tóxicos para los adipocitos maduros, lo que complica su mantenimiento. A diferencia de los métodos comúnmente utilizados que se basan en la diferenciación in vitro de los preadipocitos, este protocolo nos permite estudiar adipocitos aislados ex vivo, que son funcional y transcripcionalmente similares a los adipocitos in vivo. Esto es particularmente importante ya que los adipocitos varían mucho entre los depósitos de grasa y en diferentes condiciones dietéticas.Este protocolo aísla de manera eficiente, reflejando los adipocitos maduros y es fácilmente escalable. Se incluyen ajustes para optimizar el aislamiento de adipocitos de ratones de diferentes sexos y con diferentes condiciones dietéticas. Una vez aislados, los adipocitos pueden cultivarse, visualizarse o utilizarse de otro modo según sea necesario.Para empezar, prepare una solución de colagenasa con DNasa añadiendo 0,00017 gramos de DNasa por un mililitro de solución de colagenasa, y vórtee la mezcla para asegurar una mezcla completa. Con una cuchilla de afeitar, pica el tejido adiposo de los ratones aislados hasta que parezca homogéneo. A continuación, transfiera el tejido picado a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.Agregue la solución preparada de colagenasa y DNasa al tejido adiposo picado y el vórtice a máxima velocidad durante siete a 10 segundos para mezclar bien los componentes. Luego coloque los tubos cónicos de 50 mililitros horizontalmente en un agitador ajustado a 220 RPM a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Después de la incubación, retire los tubos, el vórtice durante cinco segundos y verifique las muestras.Ahora, con una pipeta serológica, pase el tejido digerido a través de un tamiz a un nuevo tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue FBS igual al volumen de tejido y solución de colagenasa a través del tamiz en el mismo tubo cónico para neutralizar la colagenasa. Girar los tubos a 300 g durante tres minutos a la temperatura especificada en la tabla que se muestra aquí.A continuación, con una pipeta de 200 microlitros, deseche con cuidado la capa superior de lípidos libres. A continuación, utilice una pipeta P1000 con la punta cortada para transferir los adipocitos maduros a un tubo preparado de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento. Invierta suavemente los tubos de 15 mililitros que contienen adipocitos maduros de tres a cinco veces hasta que la capa blanca se disperse por todo el medio.Después de reposar los tubos durante 10 minutos, gírelos a la temperatura previamente determinada para separar aún más las capas. Después de eso, use una pipeta para desechar la capa superior de lípidos libres. Ahora conecte una aguja de calibre 21 a una jeringa de cinco mililitros y deslice con cuidado la aguja por el borde del tubo hasta que la parte inferior de la aguja esté por debajo de la capa del sitio de los adipocitos maduros.A continuación, tire lentamente de la jeringa para eliminar los medios de cultivo y los restos celulares. Agregue suavemente 10 mililitros de medio de cultivo al tubo. Uso de puntas de pipeta de carga de gel Deslice la punta por el borde del tubo para eliminar los medios restantes por debajo de la capa de adipocitos maduros.A continuación, centrifugar las células a 100 g durante un minuto. Con una pipeta, retire los lípidos libres. Con una punta de pipeta de carga de gel, retire los medios de cultivo que se encuentran debajo de los adipocitos.Retire los insertos de cultivo celular de una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos y colóquelos con el lado de la membrana hacia arriba en la superficie de la cubierta. Llene los pocillos alternos de la placa con medios de cultivo calientes. Con una punta de pipeta P200 cortada, transfiera 30 microlitros de adipocitos maduros empaquetados a la parte superior de un inserto Transwell.Luego, recoja con cuidado el inserto Transwell, inviértalo y colóquelo en un pocillo prellenado en la placa de 24 pocillos. Para extraer el medio de los pocillos, sujete firmemente el inserto Transwell y aspire con una pipeta P200 a través de las pequeñas aberturas de los laterales. Después de retirar el medio, mientras mantiene el Transwell en su lugar, agregue lentamente un mililitro de medio fresco a lo largo de la pared lateral del pocillo.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Biology

Biología

Debido a la conexión drástico y negativo entre la obesidad y otras comorbilidades, la investigación sobre el papel adiposo desempeña en la enfermedad y la salud en general se justifica. Se presenta un protocolo para el aislamiento y la escisión de los depósitos de tejido adiposo que permitan el estudio de tejido adiposo usando in situ y métodos in vitro.

Localización, identificación y Escisión de depósitos adiposos murino

El cultivo agregado de adipocitos maduros de membrana (MAAC) es un nuevo método para el cultivo de adipocitos humanos maduros. Aquí detallamos cómo aislar adipocitos de adiposo humano y cómo configurar MAAC.

Aislamiento y cultivo de adipocitos maduros humanos utilizando cultivos agregados de adipocitos maduros de membrana (MAAC)

Este protocolo describe el enfoque técnico para aislar subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos murinos de tejido adiposo blanco intraabdominal (WAT) mediante clasificación celular activada por fluorescencia o separación inmunomagnética de perlas.

Aislamiento de subpoblaciones de células estromales adipogénicas y fibroinflamatorias de depósitos adiposos intraabdominales murinos

Este informe describe un protocolo para el aislamiento simultáneo de preadipocytes marrones y blancos primarios de ratones recién nacidos. Las células aisladas se pueden cultivar en cultivo e inducir a diferenciarse en adipocitos blancos y marrones completamente maduros. El método permite la caracterización genética, molecular y funcional de las células de grasa primarias en cultivo.

Aislamiento Y Diferenciación De Preadipocitos Blancos Y Marrones Primarios De Ratones Recién Nacidos

Este estudio describe un nuevo método para aislar adipocitos marrones murinos para el análisis de expresión génica y proteica.

Aislar adipocitos marrones del tejido adiposo marrón interescapular murino para el análisis de expresión génica y proteica

Este protocolo describe el aislamiento de preadipocitos de ratón de la grasa subcutánea, su diferenciación en adipocitos maduros y la inducción de resistencia a la insulina. La acción de la insulina se evalúa mediante la fosforilación/activación de los miembros de la vía de señalización de la insulina a través del western blot. Este método permite la determinación directa de la resistencia/sensibilidad a la insulina en adipocitos primarios.

Adipocitos diferenciados de ratón en cultivo primario: un modelo de resistencia a la insulina

En este trabajo se describe el aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón, lo que permite estudiar la función del tejido adiposo perivascular y su relación con las células vasculares.

Aislamiento, cultivo e inducción adipogénica de preadipocitos derivados de la fracción vascular estromal a partir de tejido adiposo periaórtico de ratón

Utilizando un modelo explantado ex vivo , se cultivan pequeños fragmentos de la porción rostral del tejido adiposo visceral blanco de ratones magros durante 7–10 días, lo que permite inducir y estudiar la inflamación del tejido adiposo a medida que ocurre durante la alimentación rica en grasas.

Un modelo ratón ex vivo para inflamación del tejido adiposo con una dieta alta en grasas

Aquí se describe un protocolo para el aislamiento y cultivo de las células endoteliales murinas pulmonar. Este método consiste en la disociación mecánica y enzimática del tejido pulmonar, así como un proceso de purificación de 2 pasos con anti-PECAM-1 y anti-ICAM-2 anticuerpos conjugados a perlas magnéticas, lo que produce una población pura de células endoteliales microvasculares su mayoría de origen.

Aislamiento y cultivo de células endoteliales pulmonares de ratones recién nacidos

En este reporte se describe un protocolo para el aislamiento de las poblaciones altamente purificadas de leucocitos que se infiltran en los tumores. Este protocolo es una adaptación del protocolo de Miltenyi Biotech para mejorar el rendimiento y la pureza para el aislamiento de las células del tejido tumoral compleja.

El aislamiento de las células inmunes de tumores primarios

Aprenda a aislar adipocitos maduros de ratones con diferentes condiciones dietéticas usando colagenasa y DNasa. Este protocolo escalable permite estudios funcionales ex vivo para investigar la obesidad y el metabolismo.

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