Aislamiento y cultivo de adipocitos murinos primarios de ratones delgados y obesos

Nuestra investigación se centra en investigar la función de los adipocitos maduros de diferentes depósitos de grasa y condiciones dietéticas. Estamos específicamente interesados en comprender cómo los adipocitos maduros se comunican con las células circundantes y cómo esta diafonía puede influir en la progresión de la enfermedad y alterarse en la obesidad. Los adipocitos maduros son células grandes y delicadas, lo que hace que los métodos de aislamiento celular comúnmente utilizados, como el FACS, sean ineficaces.

Además, los altos niveles de lípidos libres que a menudo se encuentran en el tejido adiposo pueden ser tóxicos para los adipocitos maduros, lo que complica su mantenimiento. A diferencia de los métodos comúnmente utilizados que se basan en la diferenciación in vitro de los preadipocitos, este protocolo nos permite estudiar adipocitos aislados ex vivo, que son funcional y transcripcionalmente similares a los adipocitos in vivo. Esto es particularmente importante ya que los adipocitos varían mucho entre los depósitos de grasa y en diferentes condiciones dietéticas.

Este protocolo aísla de manera eficiente, reflejando los adipocitos maduros y es fácilmente escalable. Se incluyen ajustes para optimizar el aislamiento de adipocitos de ratones de diferentes sexos y con diferentes condiciones dietéticas. Una vez aislados, los adipocitos pueden cultivarse, visualizarse o utilizarse de otro modo según sea necesario.

Para empezar, prepare una solución de colagenasa con DNasa añadiendo 0,00017 gramos de DNasa por un mililitro de solución de colagenasa, y vórtee la mezcla para asegurar una mezcla completa. Con una cuchilla de afeitar, pica el tejido adiposo de los ratones aislados hasta que parezca homogéneo. A continuación, transfiera el tejido picado a un tubo cónico estéril de 50 mililitros.

Agregue la solución preparada de colagenasa y DNasa al tejido adiposo picado y el vórtice a máxima velocidad durante siete a 10 segundos para mezclar bien los componentes. Luego coloque los tubos cónicos de 50 mililitros horizontalmente en un agitador ajustado a 220 RPM a 37 grados Celsius durante 10 minutos. Después de la incubación, retire los tubos, el vórtice durante cinco segundos y verifique las muestras.

Ahora, con una pipeta serológica, pase el tejido digerido a través de un tamiz a un nuevo tubo cónico estéril de 50 mililitros. Agregue FBS igual al volumen de tejido y solución de colagenasa a través del tamiz en el mismo tubo cónico para neutralizar la colagenasa. Girar los tubos a 300 g durante tres minutos a la temperatura especificada en la tabla que se muestra aquí.

A continuación, con una pipeta de 200 microlitros, deseche con cuidado la capa superior de lípidos libres. A continuación, utilice una pipeta P1000 con la punta cortada para transferir los adipocitos maduros a un tubo preparado de 15 mililitros que contenga 10 mililitros de medio de crecimiento. Invierta suavemente los tubos de 15 mililitros que contienen adipocitos maduros de tres a cinco veces hasta que la capa blanca se disperse por todo el medio.

Después de reposar los tubos durante 10 minutos, gírelos a la temperatura previamente determinada para separar aún más las capas. Después de eso, use una pipeta para desechar la capa superior de lípidos libres. Ahora conecte una aguja de calibre 21 a una jeringa de cinco mililitros y deslice con cuidado la aguja por el borde del tubo hasta que la parte inferior de la aguja esté por debajo de la capa del sitio de los adipocitos maduros.

A continuación, tire lentamente de la jeringa para eliminar los medios de cultivo y los restos celulares. Agregue suavemente 10 mililitros de medio de cultivo al tubo. Uso de puntas de pipeta de carga de gel Deslice la punta por el borde del tubo para eliminar los medios restantes por debajo de la capa de adipocitos maduros.

A continuación, centrifugar las células a 100 g durante un minuto. Con una pipeta, retire los lípidos libres. Con una punta de pipeta de carga de gel, retire los medios de cultivo que se encuentran debajo de los adipocitos.

Retire los insertos de cultivo celular de una placa de 24 pocillos tratada con cultivo de tejidos y colóquelos con el lado de la membrana hacia arriba en la superficie de la cubierta. Llene los pocillos alternos de la placa con medios de cultivo calientes. Con una punta de pipeta P200 cortada, transfiera 30 microlitros de adipocitos maduros empaquetados a la parte superior de un inserto Transwell.

Luego, recoja con cuidado el inserto Transwell, inviértalo y colóquelo en un pocillo prellenado en la placa de 24 pocillos. Para extraer el medio de los pocillos, sujete firmemente el inserto Transwell y aspire con una pipeta P200 a través de las pequeñas aberturas de los laterales. Después de retirar el medio, mientras mantiene el Transwell en su lugar, agregue lentamente un mililitro de medio fresco a lo largo de la pared lateral del pocillo.