Name: Aprovechamiento de la realidad virtual para la segmentación y el análisis inmersivos de datos de tomografía crioelectrónica (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-01-24T15:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 17 s
Description: Aprende a segmentar datos de tomografía crioelectrónica mediante realidad virtual inmersiva con el software SciGlass. Este método optimiza el análisis de estructuras mitocondriales en células de mamíferos.

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<meta charset="utf8"></head><body>Herramientas de interacción de realidad virtual: segmentación de datos Cryo-ET en 3D

<ol><li>Plitzko, J. M., Schuler, B., Selenko, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+biology+outside+the+box-inside+the+cell%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Structural biology outside the box-inside the cell.</a> Curr Opin Struct Biol. 46, 110-121 (2017).</li>
<li>Beck, M., Baumeister, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-electron+tomography%3A+can+it+reveal+the+molecular+sociology+of+cells+in+atomic+detail%5BTitle%5D)+AND+%22Trends+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Cryo-electron tomography: can it reveal the molecular sociology of cells in atomic detail.</a> Trends Cell Biol. 26 (11), 825-837 (2016).</li>
<li>Lam, V., Villa, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Practical+approaches+for+cryo-FIB+milling+and+applications+for+cellular+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Practical approaches for cryo-FIB milling and applications for cellular cryo-electron tomography.</a> Methods Mol Biol. 2215, 49-82 (2021).</li>
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<li>Watson, A. J. I., Bartesaghi, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Advances+in+cryo-ET+data+processing%3A+meeting+the+demands+of+visual+proteomics%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Advances in cryo-ET data processing: meeting the demands of visual proteomics.</a> Curr Opin Struct Biol. 87, 102861(2024).</li>
<li>Pyle, E., Zanetti, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Current+data+processing+strategies+for+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging%5BTitle%5D)+AND+%22Biochem+J%22%5BJournal%5D)">Current data processing strategies for cryo-electron tomography and subtomogram averaging.</a> Biochem J. 478 (10), 1827-1845 (2021).</li>
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<li>Ni, T., Liu, K., Zhang, J., Atanasov, I., Mladenov, M. G., Jiang, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-resolution+in+situ+structure+determination+by+cryo-electron+tomography+and+subtomogram+averaging+using+emClarity%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">High-resolution in situ structure determination by cryo-electron tomography and subtomogram averaging using emClarity.</a> Nat Protoc. 17 (2), 421-444 (2022).</li>
<li>Obr, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Exploring+high-resolution+cryo-ET+and+subtomogram+averaging+capabilities+of+contemporary+DEDs%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Exploring high-resolution cryo-ET and subtomogram averaging capabilities of contemporary DEDs.</a> J Struct Biol. 214 (2), 107852(2021).</li>
<li>Tegunov, D., Xue, L., Dienemann, C., Cramer, P., Mahamid, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Multi-particle+cryo-EM+refinement+with+M+visualizes+ribosome-antibiotic+complex+at+3.5+%C3%85+in+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Multi-particle cryo-EM refinement with M visualizes ribosome-antibiotic complex at 3.5 Å in cells.</a> Nat Methods. 18 (2), 186-193 (2021).</li>
<li>Salfer, M., Collado, J. F., Baumeister, W., Fernández-Busnadiego, R., Martínez-Sánchez, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Reliable+estimation+of+membrane+curvature+for+cryo-electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+Comput+Biol%22%5BJournal%5D)">Reliable estimation of membrane curvature for cryo-electron tomography.</a> PLoS Comput Biol. 16 (8), e1007962(2020).</li>
<li>Barad, B. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantifying+organellar+ultrastructure+in+cryo-electron+tomography+using+a+surface+morphometrics+pipeline%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Quantifying organellar ultrastructure in cryo-electron tomography using a surface morphometrics pipeline.</a> J Cell Biol. 222 (2), e202204093(2023).</li>
<li>Martinez-Sanchez, A., Garcia, I., Asano, S., Lucic, V., Fernandez, J. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Robust+membrane+detection+based+on+tensor+voting+for+electron+tomography%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Robust membrane detection based on tensor voting for electron tomography.</a> J Struct Biol. 186 (1), 49-61 (2014).</li>
<li>Heebner, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deep+learning-based+segmentation+of+cryo-electron+tomograms%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Deep learning-based segmentation of cryo-electron tomograms.</a> J Vis Exp. (189), e64435(2022).</li>
<li>Garza-López, E., Robles-Flores, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protocols+for+generating+surfaces+and+measuring+3D+organelle+morphology+using+Amira%5BTitle%5D)+AND+%22Cells%22%5BJournal%5D)">Protocols for generating surfaces and measuring 3D organelle morphology using Amira.</a> Cells. 11 (1), 65(2021).</li>
<li>Chen, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Convolutional+neural+networks+for+automated+annotation+of+cellular+cryo-electron+tomograms%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Convolutional neural networks for automated annotation of cellular cryo-electron tomograms.</a> Nat Methods. 14 (10), 983-985 (2017).</li>
<li>Lamm, L., et al. MemBrain v2: an end-to-end tool for the analysis of membranes in cryo-electron tomography. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aLamm%2C+L+%22bioRxiv%22">bioRxiv</a>. , (2024).</li>
<li>Pidhorskyi, S., Morehead, M., Jones, Q., Spirou, G., Doretto, G. syGlass: interactive exploration of multidimensional images using virtual reality head-mounted displays. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aPidhorskyi%2C+S+%22arXiv%22">arXiv</a>. , (2018).</li>
<li>Schindelin, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fiji%3A+an+open-source+platform+for+biological-image+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Fiji: an open-source platform for biological-image analysis.</a> Nat Methods. 9 (7), 676-682 (2012).</li>
<li>Tegunov, D., Cramer, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+cryo-electron+microscopy+data+preprocessing+with+Warp%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">Real-time cryo-electron microscopy data preprocessing with Warp.</a> Nat Methods. 16 (11), 1146-1152 (2019).</li>
<li>Bepler, T., Kelley, K., Noble, A. J., Berger, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Topaz-Denoise%3A+general+deep+denoising+models+for+cryoEM+and+cryoET%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Topaz-Denoise: general deep denoising models for cryoEM and cryoET.</a> Nat Commun. 11, 5208(2020).</li>
<li>Buchholz, T. -O., Berninger, L., Maurer, M., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cryo-CARE%3A+content-aware+image+restoration+for+cryo-transmission+electron+microscopy+data%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+IEEE+Int+Symp+Biomed+Imaging%22%5BJournal%5D)">Cryo-CARE: content-aware image restoration for cryo-transmission electron microscopy data.</a> Proc IEEE Int Symp Biomed Imaging. 16, 502-506 (2019).</li>
<li>Buchholz, T. -O., Jordan, M., Pigino, G., Jug, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Content-aware+image+restoration+for+electron+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">Content-aware image restoration for electron microscopy.</a> Methods Cell Biol. 152, 277-289 (2019).</li>
<li>Liu, Y. -T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotropic+reconstruction+for+electron+tomography+with+deep+learning%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Commun%22%5BJournal%5D)">Isotropic reconstruction for electron tomography with deep learning.</a> Nat Commun. 13, 6482(2022).</li>
<li>Kremer, J. R., Mastronarde, D. N., McIntosh, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Computer+visualization+of+three-dimensional+image+data+using+IMOD%5BTitle%5D)+AND+%22J+Struct+Biol%22%5BJournal%5D)">Computer visualization of three-dimensional image data using IMOD.</a> J Struct Biol. 116 (1), 71-76 (1996).</li>
</ol>

<table><tbody><tr>Formato de datos <td></td><td></td><td>CryoET</td><td>: pila TIFF, TIFF,</td></tr><tr><td>HTC, VIVE, Cosmos</td>, <td>HTC</td><td>99HARL000-00</td><td>https://www.vive.com/sea/product/vive-cosmos/features/</td></tr> <tr><td>Intel(R) Core(TM) i7-10870H CPU @ 2.20 GHz 2.21 GHz</td><td>Intel</td><td></td><td>https://ark.intel.com/content/www/us/en/ark/products/208018/intel-core-i7-10870h-processor-16m-cache-up-to-5-00-ghz.html</td></tr><tr><td>NVIDIA GPU GeForce RTX 3070 para portátiles</td><td>NVIDIA</td><td></td><td>https://www.nvidia.com/en-us/geforce/laptops/compare/30-series/</td></tr> <tr><td>syGlass Software</td><td>syGlass</td><td></td><td>syGlass instalado en un PC con Windows compatible</td></tr><tr><td>VIVE Cosmos Hand Controllers</td><td>HTC</td><td>99HAFR001-00</td><td>https://www.vive.com/us/accessory/cosmos-controller-right/</td></tr> <tr><td>Windows 11 Home</td><td>Microsoft</td><td></td><td>Inicio de Microsoft Windows 11</td></tr></tbody></table>

aprovechamiento de la realidad virtual para la segmentación y el análisis inmersivos de datos de tomografía crioelectrónica

Leveraging Virtual Reality for Immersive Segmentation and Analysis of Cryo-Electron Tomography Data

En este estudio, segmentamos tomografías que contenían mitocondrias y orgánulos membranosos adicionales (p. ej., vesículas, retículo endoplásmico) utilizando syGlass. Los tomogramas se reconstruyeron inicialmente en Warp utilizando una proyección ponderada a 16,00 Å/píxel y se sometieron a la corrección de cuña faltante y a la eliminación de ruido utilizando el software IsoNet. Los siguientes tomogramas se sometieron a un procesamiento adicional para la importación, como se muestra en la Figura 1A (consulte también Video Suplementario S1, Video Suplementario S2, Video Suplementario S3 y Video Suplementario S4).
Después del preprocesamiento, los tomogramas en formato MRC se convirtieron en pilas TIFF utilizando ImageJ, con inversión de contraste aplicada para hacer que las membranas aparecieran blancas sobre un fondo negro. A continuación, se realizó la ecualización del histograma para mejorar aún más el contraste; Esto también permite un umbral más eficaz. Las pilas TIFF se importaron y visualizaron en 3D dentro de un entorno de realidad virtual inmersivo, proporcionando una inspección detallada de las estructuras membranosas utilizando la herramienta de corte en el software que se muestra en la Figura 1B.
La segmentación manual se realizó en el software, con ventanas configuradas en automático y ajustes de brillo/umbral para optimizar la visibilidad de las funciones celulares. Los ROI en torno a las mitocondrias y otras estructuras se definieron utilizando los controladores de realidad virtual. La herramienta de segmentación permitió una delineación precisa de los límites de la membrana, con errores corregidos mediante la función de borrado. La navegación corte por corte o en 3D utilizando la herramienta ROI para cuadrar regiones en todo el tomograma, combinada con la herramienta de pincel ajustable, garantizó una segmentación precisa de las membranas mitocondriales y otros orgánulos, como se muestra en la Figura 1C.
Los datos segmentados se visualizaron generando una malla utilizando la opción de superficies de la herramienta ROI, con iteraciones de suavizado establecidas en 12 y nivel de resolución establecido en 3. Las representaciones 3D finales muestran claramente las estructuras mitocondriales, incluidas las membranas externas e internas, las crestas y los depósitos de fosfato de calcio como se muestra en la Figura 1D (consulte también el Video Suplementario S5, el Video Suplementario S6, el Video Suplementario S7 y el Video Suplementario S8).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67849/67849fig01.jpg"> 
Figura 1: Flujo de trabajo de visualización, segmentación y renderizado 3D de tomografías con sirglass. (A) Cortes tomográficos de células RPE1 de borde delgado. Tomogramas corregidos por IsoNet reconstruidos en Warp y utilizados para la segmentación con syGlass, visualizados con IMOD25. Las tomografías se recogieron en un microscopio Titan-Krios de 300 keV equipado con un detector K3 y se centraron en los bordes finos de las células del epitelio de la retina. Cada tomografía contiene al menos una mitocondria junto con varios otros orgánulos unidos a la membrana. Estas imágenes son imágenes fijas de los vídeos que se muestran en el vídeo complementario S1, el vídeo complementario S2, el vídeo complementario S3 y el vídeo complementario S4. (B) Tomogramas correspondientes visualizados en el software. Corte tomográfico creado con la herramienta de corte en el software VR después de optimizar el umbral, el brillo y la ventana, revelando estructuras celulares distintas. (C) Tomogramas visualizados en el software con membranas segmentadas. Corte tomográfico creado con la herramienta de corte en el software de realidad virtual, superpuesto con la segmentación correspondiente. Los depósitos de fosfato de calcio se muestran en amarillo, las membranas mitocondriales en cian y otras membranas como vesículas y la membrana plasmática en púrpura. (D) Renderizado 3D de las membranas segmentadas en syGlass. Las membranas mitocondriales, incluidas las crestas, las membranas mitocondriales externas e internas, se muestran en cian. Los depósitos de fosfato de calcio son de color amarillo o verde, las vesículas y la membrana plasmática de color púrpura y el retículo endoplásmico de color canela. Estas imágenes son imágenes fijas de los vídeos que se muestran en Vídeos complementarios S5, Vídeo complementario S6, Vídeo complementario S7 y Vídeo complementario S8. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video Suplementario S1: Tomograma de la muestra RPE-1_1 utilizada para la segmentación en este estudio. Este tomograma se reconstruye a 16 Å/píxel con Warp, luego se elimina el ruido y se corrige la cuña faltante con IsoNet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1a-Edward-Eng.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video suplementario S2: Tomograma de la muestra RPE-1_2 utilizada para la segmentación en este estudio. Este tomograma se reconstruye a 16 Å/píxel con Warp, luego se elimina el ruido y se corrige la cuña faltante con IsoNet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1b-Edward-Eng.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video Suplementario S3: Tomograma de la muestra RPE-1_3 utilizada para la segmentación en este estudio. Este tomograma se reconstruye a 16 Å/píxel con Warp, luego se elimina el ruido y se corrige la cuña faltante con IsoNet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1c-Edward-Eng.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Video Suplementario S4: Tomograma de la muestra RPE-1_4 utilizada para la segmentación en este estudio. Este tomograma se reconstruye a 16 Å/píxel con Warp, luego se elimina el ruido y se corrige la cuña faltante con IsoNet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile1d-Edward-Eng.avi" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Vídeo complementario S5: La segmentación resultante de la muestra RPE-1_1 después de generar superficies. Las membranas mitocondriales se muestran en cian; Los fosfatos de calcio dentro de las mitocondrias se representan en amarillo; el retículo endoplásmico se muestra en color canela; y otras membranas se muestran en color púrpura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2a-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Vídeo complementario S6: La segmentación resultante de la muestra RPE-1_2 después de generar superficies. Las membranas mitocondriales se muestran en cian; Los fosfatos de calcio dentro de las mitocondrias se representan en amarillo; el retículo endoplásmico se muestra en color canela; y otras membranas se muestran en color púrpura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2b-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Vídeo complementario S7: La segmentación resultante de la muestra RPE-1_3 después de generar superficies. Las membranas mitocondriales se muestran en cian; Los fosfatos de calcio dentro de las mitocondrias se representan en amarillo; el retículo endoplásmico se muestra en color canela; y otras membranas se muestran en color púrpura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2c-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Vídeo complementario S8: La segmentación resultante de la muestra RPE-1_4 después de generar superficies. Las membranas mitocondriales se muestran en cian; Los fosfatos de calcio dentro de las mitocondrias se representan en amarillo; el retículo endoplásmico se muestra en color canela; y otras membranas se muestran en color púrpura. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67849/67849_SuppFile2d-Edward-Eng.mp4" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Aprovechamiento de la realidad virtual para la segmentación y el análisis inmersivos de datos de tomografía crioelectrónica

Cryo-electron tomography (cryo-ET) is a powerful technique for visualizing the ultrastructure of cells in three dimensions (3D) at nanometer resolution. ...

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Investigación

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Biology

Biología

El cuello de botella para la microscopía electrónica 3D celular es la extracción de características (segmentación) en mapas muy complejos de densidad 3D. Hemos desarrollado un conjunto de criterios, que proporciona orientación sobre qué enfoque de segmentación (manual, semiautomático o automático) es el más adecuado para los diferentes tipos de datos, proporcionando así un punto de partida para la segmentación efectiva.

Desde Voxels al Conocimiento: Una Guía Práctica para la segmentación del Complejo Microscopía Electrónica 3D-Data

La tubería descrita está diseñada para la segmentación de conjuntos de datos de microscopía electrónica mayores que gigabytes, para extraer morfologías de células enteras. Una vez que las células se reconstruyen en 3D, el software personalizado diseñado en torno a las necesidades individuales se puede utilizar para realizar un análisis cualitativo y cuantitativo directamente en 3D, también utilizando la realidad virtual para superar la oclusión de la vista.

Un método para la reconstrucción 3D y el análisis de realidad virtual de células gliales y neuronales

Uso de molienda de haz de iones enfocado para producir láminas vítreas en la rejilla a partir de muestras biológicas congeladas por inmersión para tomografía crioelectrónica.

Preparación de laminillas a partir de muestras biológicas vítreas utilizando un microscopio electrónico de barrido de doble haz para la criotomografía electrónica

La creciente demanda de recopilación de datos a gran escala en la tomografía electrónica criogénica requiere rutinas de adquisición de imágenes de alto rendimiento. Aquí se describe un protocolo que implementa los desarrollos recientes de estrategias de adquisición avanzadas destinadas a maximizar la eficiencia del tiempo y el rendimiento de la recopilación de datos tomográficos.

Estrategias para la optimización de la adquisición de datos de tomografía electrónica criogénica

El presente protocolo describe la adquisición remota de datos por criotomografía electrónica de alta resolución utilizando Tomo5 y el posterior procesamiento de datos y el promedio de subtomografías utilizando emClarity. La apoferritina se utiliza como ejemplo para ilustrar procesos detallados paso a paso para lograr una estructura crio-ET a una resolución de 2,86 Å.

Recopilación remota de datos por tomografía crioelectrónica y promedio de subtomografía

Este es un método para entrenar una U-Net multicorte para la segmentación multiclase de tomogramas crioelectrónicos utilizando una porción de un tomograma como entrada de entrenamiento. Describimos cómo inferir esta red a otros tomogramas y cómo extraer segmentaciones para análisis adicionales, como el promedio de subtomogramas y el rastreo de filamentos.

Segmentación basada en aprendizaje profundo de tomogramas crioelectrónicos

La tomografía crio-STEM proporciona un medio para visualizar orgánulos de células intactas sin incrustación, seccionamiento u otras preparaciones invasivas. La resolución 3D obtenida se encuentra actualmente en el rango de unos pocos nanómetros, con un campo de visión de varios micrómetros y un espesor accesible del orden de 1 μm.

Visualización de orgánulos in situ mediante tomografía crio-STEM

Este protocolo estandariza la tomografía crioelectrónica (crio-ET) para tejidos gruesos integrando la congelación a alta presión (HPF) con el método waffle, el levantamiento por haz de iones de foco criogénico (crio-FIB) y la adquisición paralela simétrica en dosis, produciendo láminas uniformemente finas y muestras vitrificadas para análisis in situ reproducibles en el hipocampo del ratón.

Flujo de trabajo de criotomografía electrónica para tejidos gruesos demostrado en hipocampo de ratón

Este artículo describe un nuevo protocolo y el reactivo conjunto diseñado para la medición sensible de los efectos neurotóxicos de los compuestos y los tratamientos en co-cultivos de neuronas y astrocitos utilizando el análisis de contenido de alta. Los resultados demuestran que el análisis de contenido de alta tecnología representa una apasionante novela para la evaluación de la neurotoxicidad.

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