Medición de citometría de flujo de alto rendimiento del mecanotipo celular basada en la ruptura y la entrega de sondas de tensión de ADN en las células

Nuestro laboratorio generalmente estudia los mecanismos moleculares que usan las células para transmitir estímulos mecánicos. Recientemente, hemos estado desarrollando métodos de alto rendimiento para medir las fuerzas que las células ejercen sobre su entorno para llevar la mecanobiología a la era ómica. Los estudios implican fuerzas mecánicas en la forma en que las células T son activadas por el antígeno correcto y cómo las células madre se diferencian en tipos de células especializadas.

Recientemente, la focalización de los procesos subyacentes a la mecánica celular desregulada ha llevado al desarrollo de los mecanoterapéuticos como una vía para tratar la enfermedad. Los sensores dúplex y de horquilla de ADN miden las fuerzas extracelulares, mientras que los sensores codificados genéticamente permiten mediciones intracelulares. Casi todos requieren microscopios de alta gama.

La microscopía de fuerza de tracción puede medir la fuerza que las células ejercen sobre su entorno, pero también implica imágenes de alta resolución. En este trabajo abordamos tres desafíos en el campo, uno, el uso de citometría de flujo para la medición de fuerza en lugar de imágenes, dos, el empleo de la tecnología de etiquetas HOH para unir ligandos y anticuerpos a las sondas de ADN, y tres, la utilización de placas de cultivo celular estándar sin tratamientos superficiales especiales. ¿Cómo se pueden utilizar los cambios en las fuerzas generadas por las células como marcador pronóstico del estado de la enfermedad, y contribuyen estas fuerzas a dicho estado de enfermedad o son un efecto secundario de él?

Para comenzar, ensamble dúplex en una proporción de 1.1 a un molar de hebra de anclaje con extintor a hebra de ligando con fluoróforo. Prepare los dúplex a una concentración final de 40 hebras de ligandos micromolares en la solución. Para recocer los dúplex ensamblados, incubarlos a 98 grados centígrados durante cinco minutos.

Luego, deje que la mezcla se enfríe a temperatura ambiente durante una hora lejos de la luz. Reaccione los dúplex recocidos con HUH utilizando la concentración de la hebra menos abundante del paso de recocido, que en este caso es la hebra del ligando. Mezcle los dúplex con HUH en una proporción de uno a dos molares a una concentración final de 10 micromolares dúplex y 20 micromolares HUH.

Incubar la reacción a 37 grados centígrados durante 30 minutos en un termociclador o en un bloque de calor protegido de la luz. Después de la incubación, elimine la reacción del calor y use una mini centrífuga de sobremesa para hacer girar las correas del medidor de tensión o TGT ahora ensambladas. Cuando los TGT se adhieran adecuadamente, lave los pocillos con las celdas deseadas tres veces con PBS.

A continuación, realice dos lavados con medios sin suero y deje los medios en los pocillos después del lavado final. Agregue 200 microlitros de PBS a los pozos periféricos para mitigar los efectos de borde. Transfiera la placa a una incubadora a 37 grados centígrados para precalentar la placa.

A continuación, recupere las celdas de interés con una confluencia de aproximadamente el 80%. Aspire el medio, luego lave las células con PBS e incube las células con tripsina a 37 grados Celsius hasta que las células se disocien, lo que tarda aproximadamente de cinco a 10 minutos. Una vez que las células estén disociadas, agregue el volumen original de medios celulares completos utilizados para mantener las celdas.

Vuelva a suspender las células con una pipeta serológica y transfiera la suspensión celular a un tubo cónico de 15 mililitros. Centrifugar las células a 300 G durante cuatro minutos. Aspire el medio y vuelva a suspender el pellet en PBS.

Después de repetir la centrifugación, vuelva a suspender las células en cinco mililitros de medio sin suero y vuelva a centrifugar. Aspire y vuelva a suspender las células en aproximadamente dos mililitros de medios libres de suero. Determine la densidad de las células resuspendidas para ajustar la concentración según lo desee.

Opcionalmente, si se prueban los efectos del medicamento, agregue la concentración adecuada del medicamento a las células y devuélvalas a la incubadora durante el tiempo de preincubación antes de continuar. Ahora, recupere la placa original de la incubadora y retire los medios residuales que quedaron del lavado en los pozos experimentales. Lave los pocillos una vez con el medio deseado y pipetee 100 microlitros de las células resuspendidas en los pocillos deseados.

Transfiera las celdas plateadas a la incubadora durante 90 minutos. Después de la incubación, retire aproximadamente de 125 a 170 microlitros de volumen de cada pocillo. Si es necesario, lave las celdas suavemente con 200 microlitros de PBS calentado.

Luego, incube las células en cada pocillo con 50 microlitros de tripsina hasta que las células comiencen a disociarse, lo que toma aproximadamente de cinco a 10 minutos. A continuación, agregue 160 microlitros de tampón de flujo recién preparado a cada pocillo. Pipetear suavemente hacia arriba y hacia abajo para disociar las células.

Transfiera 196 microlitros de esta suspensión celular a tubos de PCR, agregue cuatro microlitros de yoduro de propidio y mezcle suavemente. Finalmente, coloque los tubos en una cubeta de hielo con una tapa que bloquee cualquier luz y mida la intensidad de fluorescencia con un citómetro de flujo. La activación por citometría de flujo confirmó el éxito del aislamiento de una sola célula viva, lo que garantiza un análisis preciso del mecanotipo.

Una compuerta de control negativa, establecida en el percentil 99 de la fluorescencia Cy5-A, proporcionó una línea de base para la comparación de las condiciones experimentales. Las células CHO-K1 tratadas con Y27632 mostraron una disminución significativa en el porcentaje de células que superaron la puerta de control negativa en los TGT de cizallamiento, mientras que los TGT de descompresión mostraron solo una disminución modesta y estadísticamente insignificante. El descomprimimiento de los TGT dio como resultado un mayor porcentaje de celdas que superaron el control negativo en comparación con los TGT de cizallamiento, lo que confirma su menor requerimiento de fuerza.