Name: Generación de cultivos primarios para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-02T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 38 s
Description: Aprende a generar cultivos primarios de queratinocitos para obtener imágenes de células vivas. Este protocolo permite observar procesos celulares en tiempo real y estudia la función de barrera de la piel.

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<ol><li>Mateu, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+differences+between+neonatal+and+adult+fibroblasts+and+keratinocytes%3A+Donor+age+affects+epithelial-mesenchymal+crosstalk+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Mol+Med%22%5BJournal%5D)">Functional differences between neonatal and adult fibroblasts and keratinocytes: Donor age affects epithelial-mesenchymal crosstalk in vitro.</a> Int J Mol Med. 38 (4), 1063-1074 (2016).</li>
<li>Handl, J., Čapek, J., Majtnerová, P., Báčová, J., Roušar, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+repeated+passaging+on+the+susceptibility+of+human+proximal+tubular+HK-2+cells+to+toxic+compounds%5BTitle%5D)+AND+%22Phy+Res+Aca+Sci+Boh%22%5BJournal%5D)">The effect of repeated passaging on the susceptibility of human proximal tubular HK-2 cells to toxic compounds.</a> Phy Res Aca Sci Boh. 69 (4), 731-738 (2020).</li>
<li>Xiao, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Short+cell+cycle+duration+is+a+phenotype+of+human+epidermal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">Short cell cycle duration is a phenotype of human epidermal stem cells.</a> Stem Cell Res The. 15 (1), 76(2024).</li>
<li>Noujarède, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sphingolipid+paracrine+signaling+impairs+keratinocyte+adhesion+to+promote+melanoma+invasion%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Sphingolipid paracrine signaling impairs keratinocyte adhesion to promote melanoma invasion.</a> Cell Rep. 42 (12), 113586(2023).</li>
<li>Sun, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+image-based+dynamic+high-throughput+analysis+of+adherent+cell+migration%5BTitle%5D)+AND+%22Bio-prol%22%5BJournal%5D)">An image-based dynamic high-throughput analysis of adherent cell migration.</a> Bio-prol. 11 (6), e3957(2021).</li>
<li>Chapman, S., McDermott, D. H., Shen, K., Jang, M. K., McBride, A. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+Rho+kinase+inhibition+on+long-term+keratinocyte+proliferation+is+rapid+and+conditional%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Res+The%22%5BJournal%5D)">The effect of Rho kinase inhibition on long-term keratinocyte proliferation is rapid and conditional.</a> Stem Cell Res The. 5 (2), 60(2014).</li>
<li>U.S. Department of Health and Human Services. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Biosafety+in+microbiological+and+biomedical+laboratories%22">Biosafety in microbiological and biomedical laboratories</a>. , 6th edition, Centers for Disease Control and Prevention, National Institutes of Health. USA. (2020).</li>
<li>Poumay, Y., Roland, I. H., Leclercq-Smekens, M., Leloup, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Basal+detachment+of+the+epidermis+using+dispase%3A+tissue+spatial+organization+and+fate+of+integrin+alpha+6+beta+4+and+hemidesmosomes%5BTitle%5D)+AND+%22J+Inv+Der%22%5BJournal%5D)">Basal detachment of the epidermis using dispase: tissue spatial organization and fate of integrin alpha 6 beta 4 and hemidesmosomes.</a> J Inv Der. 102 (1), 111-117 (1994).</li>
<li>Tsuji, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+different+cell-detaching+methods+on+the+viability+and+cell+surface+antigen+expression+of+synovial+mesenchymal+stem+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CellTra%22%5BJournal%5D)">Effects of different cell-detaching methods on the viability and cell surface antigen expression of synovial mesenchymal stem cells.</a> CellTra. 26 (6), 1089-1102 (2017).</li>
<li>Rheinwald, J. G., Green, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Serial+cultivation+of+strains+of+human+epidermal+keratinocytes%3A+the+formation+of+keratinizing+colonies+from+single+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells.</a> Cell. 6 (3), 331-343 (1975).</li>
<li>Boisseau, A. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Production+of+epidermal+sheets+in+a+serum+free+culture+system%3A+a+further+appraisal+of+the+role+of+extracellular+calcium%5BTitle%5D)+AND+%22J+Der+Sci%22%5BJournal%5D)">Production of epidermal sheets in a serum free culture system: a further appraisal of the role of extracellular calcium.</a> J Der Sci. 3 (2), 111-120 (1992).</li>
<li>Roshan, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Human+keratinocytes+have+two+interconvertible+modes+of+proliferation%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Human keratinocytes have two interconvertible modes of proliferation.</a> Nat Cell Bio. 18 (2), 145-156 (2016).</li>
<li>Nanba, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EGFR-mediated+epidermal+stem+cell+motility+drives+skin+regeneration+through+COL17A1+proteolysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">EGFR-mediated epidermal stem cell motility drives skin regeneration through COL17A1 proteolysis.</a> J Cell Bio. 220 (11), e202012073(2021).</li>
<li>Ścieżyńska, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+culture+of+human+primary+keratinocytes-a+methods+review%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Isolation and culture of human primary keratinocytes-a methods review.</a> Exp Der. 28 (2), 107-112 (2019).</li>
<li>Guo, A., Jahoda, C. A. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+improved+method+of+human+keratinocyte+culture+from+skin+explants%3A+cell+expansion+is+linked+to+markers+of+activated+progenitor+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Derm%22%5BJournal%5D)">An improved method of human keratinocyte culture from skin explants: cell expansion is linked to markers of activated progenitor cells.</a> Exp Derm. 18 (8), 720-726 (2009).</li>
<li>Orazizadeh, M., Hashemitabar, M., Bahramzadeh, S., Dehbashi, F. N., Saremy, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Comparison+of+the+enzymatic+and+explant+methods+for+the+culture+of+keratinocytes+isolated+from+human+foreskin%5BTitle%5D)+AND+%22Bio+Rep%22%5BJournal%5D)">Comparison of the enzymatic and explant methods for the culture of keratinocytes isolated from human foreskin.</a> Bio Rep. 3 (3), 304-308 (2015).</li>
<li>Usta, S. N., Scharer, C. D., Xu, J., Frey, T. K., Nash, R. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemically+defined+serum-free+and+xeno-free+media+for+multiple+cell+lineages%5BTitle%5D)+AND+%22Ann+of+tra+med%22%5BJournal%5D)">Chemically defined serum-free and xeno-free media for multiple cell lineages.</a> Ann of tra med. 2 (10), 97(2014).</li>
<li>Lenihan, C., Rogers, C., Metcalfe, A. D., Martin, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+effect+of+isolation+and+culture+methods+on+epithelial+stem+cell+populations+and+their+progeny-toward+an+improved+cell+expansion+protocol+for+clinical+application%5BTitle%5D)+AND+%22Cyt%22%5BJournal%5D)">The effect of isolation and culture methods on epithelial stem cell populations and their progeny-toward an improved cell expansion protocol for clinical application.</a> Cyt. 16 (12), 1750-1759 (2014).</li>
<li>Bernstam, L. I., Vaughan, F. L., Bernstein, I. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Keratinocytes+grown+at+the+air-liquid+interface%5BTitle%5D)+AND+%22In+Vitro+Cell+Dev+Biol%22%5BJournal%5D)">Keratinocytes grown at the air-liquid interface.</a> In Vitro Cell Dev Biol. 22 (12), 695-705 (1986).</li>
<li>Ponce, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isolation+and+cultivation+of+primary+keratinocytes+from+piglet+skin+for+compartmentalized+co-culture+with+dorsal+root+ganglion+neurons%5BTitle%5D)+AND+%22J+Cell+Bio%22%5BJournal%5D)">Isolation and cultivation of primary keratinocytes from piglet skin for compartmentalized co-culture with dorsal root ganglion neurons.</a> J Cell Bio. 2 (2), 93-115 (2017).</li>
<li>Nygaard, U. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Antibiotics+in+cell+culture%3A+friend+or+foe%3F+Suppression+of+keratinocyte+growth+and+differentiation+in+monolayer+cultures+and+3D+skin+models%5BTitle%5D)+AND+%22Exp+Der%22%5BJournal%5D)">Antibiotics in cell culture: friend or foe? Suppression of keratinocyte growth and differentiation in monolayer cultures and 3D skin models.</a> Exp Der. 24 (12), 964-965 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>0,05% Tripsina-EDTA (1X), 100 mL</td><td>Gibco</td><td>25300-054</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de celda de 100 mmm</td><td>Corning</td><td>352360</td><td></td></tr><tr><td>Falcon de 15 cc</td><td>Corning</td><td>352096</td><td></td></tr><tr><td>Falcon cónico de 50 cc</td><td>Corning</td><td>352070</td><td></td></tr><tr><td>Microplaca de 6 pozos</td><td>Corning</td><td>3516</td><td></td></tr><tr><td>Alcohol reactivo al 70%, 4 L</td><td>VWR Chemicals</td><td>BDH1164-4LP</td><td>Alternativamente, puedes diluir el tuyo propio</td></tr><tr><td>Anfotericina B, 50 ml</td><td>Corning</td><td>30-003-CF</td><td>Diluir a 5X (50 ug/mL)</td></tr><tr><td>Dipasa, 100 ml</td><td>Corning</td><td>354235</td><td>Diluye 1:1 con HBSS, añade 1 x gentamicina, filtra y esteriliza</td></tr><tr><td>Epilife, 50 mL</td><td>Gibco</td><td>MEP1500CA</td><td>Añade HKGS, considera antibióticos</td></tr><tr><td>Valor sérico bovino fetal FBS inactivado por calor, 500 ml</td><td>Gibco</td><td>A52568-01</td><td>FBS</td></tr><tr><td>Fórceps</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gentamicina, 10 ml</td><td>Gibco</td><td>15750-060</td><td>Diluir a 50 ug/ml durante 5X</td></tr><tr><td>Solución salina balanceada de Hank (1X), 500 ml</td><td>Gibco</td><td>14170-112</td><td>(HBSS)</td></tr><tr><td>HBSS 5X PSAG</td><td></td><td></td><td>Esto es HBSS + 5 veces las concentraciones de Pen/Streptococo/Ampho/Gent</td></tr><tr><td>Hibiclens, galón</td><td>Molnlycke</td><td>57591</td><td>Diluye hasta un 10% usando H2O desionizado</td></tr><tr><td>Suero de crecimiento de queratinocitos humanos, 5 mL</td><td>Gibco</td><td>S-001-5</td><td>Añadido a epilife</td></tr><tr><td>Penicilina/Estreptomicina, 100 ml</td><td>Corning</td><td>30-002-Cl</td><td>Diluir a 5X (viene en 100x de serie) para 5X PSA - 1X para cambios de soporte</td></tr><tr><td>Placa de Petri 100 mm x 15 mm</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB0875713</td><td></td></tr><tr><td>Bisturí NO 23</td><td>VWR</td><td>76457-480</td><td></td></tr><tr><td>Triple</td><td>Gibco</td><td>12604021</td><td>Una alternativa menos cáustica a la tripsina normal</td></tr><tr><td>Solución neutralizante de tripsina</td><td></td><td></td><td>(TNS), esto es HBSS con un 10% de FBS (algunos usan menos suero, 5%)</td></tr></tbody></table>

generación de cultivos primarios para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos

Generating Primary Cultures for Keratinocyte Live Cell Imaging

Generación de cultivos primarios para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos

Tracking stem cells and committed progenitor behavior at the single-cell level in human skin has been challenging both in vivo and in ...

generating-primary-cultures-for-keratinocyte-live-cell-imaging

Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Generación de las Culturas Raft organotípicos de queratinocitos humanos primarios

Este video describe el aislamiento de queratinocitos, las células más prominentes de la capa epidérmica de la piel humana, mediante el empleo de una combinación de métodos de digestión enzimática y disrupción mecánica. Este método ayuda en el crecimiento preferencial de los queratinocitos sobre otros tipos de células de la piel utilizando un medio de crecimiento selectivo.

Aislamiento de queratinocitos de piel humana: un método para cultivar queratinocitos primarios a partir de muestras de piel

En este video, realizamos un ensayo clonogénico de queratinocitos recolectados de ratones adultos para determinar la capacidad de las células individuales para proliferar y formar colonias. Esta técnica de recolección de queratinocitos es útil para estudiar otros aspectos posteriores de la carcinogénesis química cutánea y la promoción tumoral.

Ensayo de formación de colonias de queratinocitos: un ensayo in vitro para evaluar la capacidad de los queratinocitos para convertirse en colonias

Este manuscrito proporciona un procedimiento paso a paso para la derivación y el mantenimiento de queratinocitos humanos a partir de pelo arrancado y la posterior generación de células madre pluripotentes inducidas humanas (hiPSCs) libres de integración por vectores episomales.

Generación de células madre Integración de libre Humanos pluripotentes inducidas Usando derivada de pelo queratinocitos

El objetivo de este artículo es proporcionar un protocolo completo y detallado sobre cómo generar piel organotípica humana modificada genéticamente a partir de queratinocitos epidérmicos y dermis humana desvitalizada.

Generación de Genéticamente Modificados cultivos de piel organotípicos Uso Desvitalizada Dermis Humana

Los queratinocitos epidérmicos forman una barrera cutánea funcional y se sitúan en la línea de frente de la defensa del huésped contra insultos ambientales externos. Aquí se describen métodos de aislamiento y cultivo primario de queratinocitos epidérmicos de piel de ratón neonatal y adulto, e inducción de diferenciación terminal y respuesta inflamatoria desencadenada por UVB a partir de queratinocitos.

Aislamiento y cultivo de queratinocitos de ratón primario de piel de ratón neonatal y adulto

La piel humana actúa como primera línea de defensa contra el medio ambiente externo. Presentamos un método para aislar queratinocitos humano primario de piel adulto. Estos queratinocitos aislados son útiles en numerosas configuraciones experimentales y son un modelo muy adecuado para el estudio de mecanismos moleculares en biología cutánea en vitro.

Generación y cultivo de Keratinocytes humanos primarios de piel adulto

Aquí presentamos un protocolo para aislar eficientemente keratinocytes humanos primarios de tejidos de la piel adulta. Este método simplifica el procedimiento convencional mediante el uso de la Y-27632 del inhibidor de la roca en el medio de inoculación separar espontáneamente las células epidérmicas de las células cutáneas.

Un método simplificado y eficiente para aislar Keratinocytes humanos primarios de tejido adulto de la piel

El objetivo de este protocolo es aislar los queratinocitos epidérmicos de la piel dorsal de ratones adultos para una variedad de aplicaciones aguas abajo, como biología molecular, bioquímica, clasificación celular activada por fluorescencia y usos primarios in vitro (por ejemplo, clonogénicos queratinocitos).

Aislamiento de los queratinocitos epidérmicos de ratón y su cultivo clonogénico In Vitro

Aquí describimos un protocolo para el cultivo sistemático de esferoides epidérmicos en cultivo de suspensión 3D. Este protocolo tiene una amplia gama de aplicaciones para su uso en una variedad de tipos de tejidos epiteliales y para el modelado de varias enfermedades y afecciones humanas.

Establecimiento de un sistema de cultivo de esferoides epidérmicos de alto rendimiento para modelar la plasticidad de las células madre de queratinocitos

Aquí, proporcionamos un método para el análisis de imágenes de células vivas que se puede utilizar para rastrear manualmente los linajes de los queratinocitos de paso 0 y que permite la recopilación de métricas de proliferación, incluido el destino de la división celular y la duración del ciclo celular.

Imágenes de células vivas con fotografía de lapso de tiempo para estudiar la cinética de proliferación de queratinocitos epidérmicos

Aprende a generar cultivos primarios de queratinocitos para obtener imágenes de células vivas. Este protocolo permite observar procesos celulares en tiempo real y estudia la función de barrera de la piel.

Generación de cultivos primarios para la obtención de imágenes de células vivas de queratinocitos

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