Imágenes de células vivas con fotografía de lapso de tiempo para estudiar la cinética de proliferación de queratinocitos epidérmicos

Esta investigación se centra en enfermedades hiperproliferativas e hipoproliferativas como la psoriasis y el envejecimiento, con énfasis en cómo estas condiciones afectan a la proliferación de células madre y progenitoras. Identificar los sitios específicos de defectos proliferativos permitirá el desarrollo de terapias más precisas y dirigidas. Para la epidermis humana, no hemos tenido técnicas que permitan rastrear progenitores comprometidos durante varias generaciones.

Por último, la imagen de células vivas nos permite seguir a un progenitor comprometido a través de múltiples generaciones in vitro y nos ha proporcionado muchas ideas sobre el comportamiento de los progenitores comprometidos en humanos. Hemos utilizado la imagen de células vivas para demostrar que, aunque sabemos que las células madre se dividen con menos frecuencia que los progenitores comprometidos, cuando se dividen, se dividen más rápidamente. Cuando se produce daño en los tejidos, las células madre pueden responder mediante una rápida renovación.

Para empezar, obtén queratinocitos de piel humana fresca. Determinar la densidad de siembra adecuada para el ensayo y realizar estudios piloto utilizando muestras con múltiples diluciones de diferentes donantes. Para lograr una distribución uniforme de las células, se aplica el medio total necesario para todos los pozos a una dilución específica en un microtubo.

Pipeta el número total de células necesarias para alcanzar la densidad deseada en la alícuota e invierte suavemente el microtubo para distribuir las células de forma homogénea. Ahora, añade la suspensión a las placas. Después de la placa, mueve la placa en forma de cruz tres veces arriba, abajo, luego izquierda, derecha, y transfiere cuidadosamente la placa a la incubadora.

Después de la incubación, cambia el medio. Para abrir la incubadora del sistema de imagen, pulse el gran botón triangular en la parte inferior izquierda. Cuando la luz se ponga verde, coloca el recipiente en una bahía abierta y cierra la bandeja usando el mismo botón.

Ahora abre la aplicación en el ordenador e inicia sesión usando la identificación de usuario y la contraseña correspondientes. Luego selecciona Programar. Pulsa el botón Plus debajo del Horario para añadir la matrícula al Calendario.

Selecciona Escanear en el horario y luego haz clic en Siguiente. Luego selecciona Nuevo y selecciona Estándar para Tipo de escaneo. Para la configuración de escaneo, selecciona adherente Celda por Celda usando el canal de fase en 10x Objetivo y luego haz clic en Siguiente.

A continuación, elige el Recipiente y luego haz clic en Siguiente. Selecciona una bahía vacía para colocar el buque y luego haz clic en Siguiente. Selecciona los pozos que se van a escanear, así como el número de imágenes por pozo y luego haz clic en Siguiente.

Nombra el experimento usando la convención de nombres deseada. Crea un mapa de placas del experimento para referencia futura. Luego haz clic en Vale.

Ahora haz clic en Siguiente para continuar. Posponer el análisis hasta después de la recogida de datos, ya que el análisis célula por célula debe iniciarse después del escaneo. Haz clic en Siguiente otra vez.

Establece la frecuencia de la imagen a intervalos de 20 minutos para seguir de forma fiable la mitosis, que ocurre aproximadamente cada 30 minutos. Pulsa Siguiente y confirma la configuración para iniciar el experimento. Cambia el medio para queratinocitos cada 48 horas.

Para asegurar la correcta orientación de la placa, espera a que termine el primer escaneo cada vez que se coloca un recipiente en la máquina. Coloca la placa de modo que las letras que indican las filas queden en el lado izquierdo de la bahía. Sigue las colonias adultas durante aproximadamente dos semanas y las colonias neonatales durante unos 10 días, momento en el que el apiñamiento reduce la calidad analítica.

Una vez que todos los pozos estén inactivos o hayan alcanzado la confluencia, haz clic en la pestaña Ver y haz doble clic en el experimento bajo la lista de Estafas Recientes. Haz clic en el icono de Paisaje con la flecha y espera a que se abra la herramienta de Exportación. Haz clic en Tal como se muestra y luego haz clic en Siguiente.

Luego haz clic manualmente en cada campo de Vista para exportar y después haz clic en Siguiente. Elige si se desea una película o una serie de imágenes. Para el rastreo de la línea de queratinocitos, elige la opción Película y selecciona todos los escaneos usando el icono Seleccionar todo y haz clic en Siguiente.

Exporta a un fotograma por segundo con máxima calidad tras ajustar la barra junto a Calidad. Después de elegir la carpeta de destino y el tipo de archivo, nombra el archivo y haz clic en Exportar. Abre el archivo de vídeo usando un reproductor multimedia y desplázate por los vídeos para identificar colonias en crecimiento.

Con VLC, haz una captura de pantalla de la colonia para que la rastrees y etiquétala. Identifica una colonia de interés al final o después de algunos días de grabación de vídeo. Rebobina el vídeo e identifica la célula que forma la colonia.

Pon en pausa el vídeo cuando la célula está a punto de dividirse, ya que parece condensarse. Anota la marca de tiempo que aparece en la esquina inferior izquierda. Haz una captura de pantalla de la división y etiquétala igual que la colonia.

Documenta cada división usando un diagrama de linaje dibujado a mano. Transcribe el árbol de linaje manual en hojas de datos denominadas hojas verdes debido al color de las hojas de cálculo. Por último, utiliza las hojas verdes para calcular las proporciones de divisiones proliferativas y de diferenciación.

Identificar las colonias de células madre y progenitores comprometidos y determinar la duración del ciclo celular. Los queratinocitos primarios mostraron una progresión estereotipada en apariencia, comenzando como pequeñas células redondeadas al iniciar la siembra, para luego aplanarse y moverse. Comienzan a condensarse antes de la división y forman colonias proliferativas o colonias terminalmente diferenciadas con morfología no uniforme.

Una vez construida la hoja verde, se puede determinar qué colonias se originan a partir de células madre y cuáles a partir de progenitores comprometidos.