Name: Caracterización del autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos de beta amiloide 1-40 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T14:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 53 s
Description: Aprende a caracterizar el autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos con beta amiloide 1-40. Este método utiliza espectroscopía SERS para estudiar cambios conformacionales y agregación de proteínas implicadas en la enfermedad de Alzheimer.

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1. Preparación de nanopartículas de oro recubiertas de Aβ 1-40
<ol>
	<li>Añadir un volumen de 1 mL de agua destilada desionizada a 1 mg de Aβ 1-40 liofilizado (MW: 4,2 kDa, 98% de pureza de HPLC) con una aguja de jeringa. Mezcle la solución con un mezclador de vórtice durante aproximadamente 30 s y asegúrese de que no se observen partículas sólidas en la solución a temperatura ambiente (RT; ~20 °C).<ol>
		<li>Prepare todas las soluciones madre utilizando agua desionizada y destilada (~18 MΩ·cm).</li>
		<li>Identificar espectroscópicamente la concentración mediante el uso de la absorción de tirosina a 275 nm32, la cual tiene un coeficiente de extinción molecular ε275 de 1390 cm-1· M-1.</li>
		<li>Almacene soluciones madre de Aβ 1-40 a -80 °C. (Véase la Tabla de Materiales para los productos comerciales de Aβ 1-40.)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Descongele la solución madre de péptidos aproximadamente 5 minutos antes de la recopilación de datos. Mezcle un volumen de 8 μL de la solución peptídica con 800 μL de partículas coloidales de oro en un tubo de centrífuga de 15 mL. Agregue un volumen de 4.2 mL de agua destilada desionizada y luego agite la muestra durante 10 s 30,31,33,34.</li>
	<li>Fije la concentración de péptidos Aβ 1-40 en 1,8 nmol y rango la proporción de péptidos Aβ 1-40. El número de coloides de oro osciló entre ~500:1 y ~2000:125.</li>
</ol>
2. Cambio iterativo de pH y monitoreo del cambio de banda SPR correspondiente
<ol>
	<li>Ajuste la temperatura de la solución a un valor determinado (por ejemplo, 25 °C) utilizando la unidad de control de temperatura del espectrofotómetro ultravioleta-visible-infrarrojo cercano (UV-Vis-NIR).</li>
	<li>Controle el pH inicial de la solución de muestra con un medidor de pH y ajústelo a un pH ligeramente inferior a 7. Recoge el espectro de absorción en el rango entre 400 nm y 1000 nm.</li>
	<li>Cambie el pH de la muestra a ~pH 4 (es decir, pH 4,0 ± 0,3) agregando volúmenes de 10 μL de HCl de 0,1 M y recoja el espectro de absorción entre 400 nm y 1000 nm.</li>
	<li>Cambie el pH de la muestra a ~pH 10 (es decir, pH 10 ± 0,3) agregando volúmenes de 10 μL de 0,1 M de NaOH y recoja el espectro de absorción entre 400 nm y 1000 nm.</li>
	<li>Cambie el pH entre pH 4 y pH 10 con HCl y NaOH 10 veces y recoja el espectro de absorción de forma continua a 25 ± 0,2 °C 29,30. NOTA: Para todas las soluciones de muestra, la densidad óptica del pico de la banda SPR se mantuvo alrededor de 0,2. Se espera un efecto tampón debido a la solución tampón residual en una solución. Por lo tanto, se determinó el valor final de pH después de que se confirmó el equilibrio. El valor de pH se midió directamente en una celda de cubeta de muestra utilizando un microelectrodo de pH, que tiene una precisión de ±0,005 pH.</li>
	<li>Obtenga el conjunto de datos del código estándar americano para el intercambio de información (ASCII) de longitudes de onda en función de la absorbancia. Extraiga la posición media de los picos de banda utilizando el programa Peak Fit .<ol>
		<li>Represente el conjunto de datos para ver la densidad óptica en función de la longitud de onda (nm) mediante la función Trazar .</li>
		<li>Marque las longitudes de onda de pico iniciales λ1, λ2 y λ3 seleccionando sus posiciones aproximadas en los datos trazados y ajuste los datos utilizando la función RUN .</li>
		<li>Obtén la gráfica que contiene el pico central de cada (λi), XCi, con el área de cada banda (Ai).</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Exporte las posiciones y áreas de pico extraídas a un programa de hoja de cálculo y calcule la posición de pico promedio a un pH dado.<ol>
		<li>Determine el factor de ponderación ai de cada centro de pico λi comparando el área de la banda (Ai) con el área total de todas las bandas como: <img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq01.jpg" style="margin: auto;">.</li>
		<li>Extraiga la posición media del pico, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> (pH) utilizando la Ec. (1). 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq03.jpg" style="margin: auto;">(1)</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Genere una gráfica de reversibilidad mediante el siguiente proceso:<ol>
		<li>Tabular las posiciones medias de los picos, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">, en función de cada número de "operación", n como <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> vs. n. Haga que el número de operación, n, sea 1 para la muestra antes de la adición de ácido a ~pH 7. Aumente el número de operación en 1 cada vez, cambiando el pH a ~pH4 con HCl o el pH a ~pH 10 con NaOH. Haga que n sea par en una condición ácida (es decir, ~pH 4) e impar que sea una condición básica (es decir, pH 10).</li>
		<li>Analice la posición del pico en cada n, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> (n) = λ(n), utilizando la fórmula30 
		<img alt="Equation 4" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq04.jpg" style="margin: auto;">(2) NOTA: Represente una posición de pico promedio inicial en n = 1 por A. Exprese los parámetros B y C como el cambio de posición de pico dependiente de n. Haga el parámetro D como una amplitud del factor de amortiguamiento, E, de repetición. Utilice la función seno para mostrar la ondulación de la posición del pico como una función de n.</li>
		<li>Transfiera el conjunto de datos de (x, y) al software Origin y tráquelo.</li>
		<li>Forme la función personalizada dada en la Ec. (2) en la función de ajuste de curva no lineal del análisis. Escriba los valores iniciales A, B, C, D y E y haga clic en EJECUTAR para completar el ajuste.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Imágenes TEM<ol>
		<li>Realice las muestras TEM de los coloides de oro de 20 nm recubiertos de Aβ 1-40 con rejillas de cobre recubiertas de Formvar. Examinar las muestras con un TEM operado a 80 kV.</li>
		<li>Recopile imágenes con un aumento nominal de 28.000x o 71.000x en una cámara digital CCD (AMT) de 4 megapíxeles modelo XR-40. Recoja las imágenes TEM de oro de 20 nm recubierto de Aβ 1-40 en cada número de operación n = 1 (~pH 7), n = 2, 4, 6, 8 y 10 (pH 4) y n = 3, 5, 7 y 9 (pH 10).</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Imágenes Raman e investigación de la agregación reversible
<ol>
	<li>Colocar 100 μL de solución en un disco de mica (diámetro de 1 cm) para cada muestra con el número de operación n. Seque las muestras durante la noche antes de la medición.</li>
	<li>Recopile imágenes de luz blanca en cada número de operación n. Prepare la muestra separada en un disco de mica, ya que el pH se alteró continuamente entre ~pH 4 y ~pH 10 para cada número de operación n (Figura 3).</li>
	<li>Recoja la imagen Raman en cada número de operación n con un láser de una longitud de onda de λ = 633 nm a una potencia de 0,5 ± 0,05 mW con una resolución espacial de ~0,43 μm en una cuadrícula de 100 × 100 píxeles con un tiempo de integración de 500 ms/espectro para la región entre ~200 cm-1 y ~2.800 cm-1 (Figura 4).</li>
	<li>Trace el espectro representativo para cada n alineado como una función de n y construya el espectro SERS tridimensional en función de n para Aβ1-40 recubierto de oro de 20 nm (Figura 5A). Utilice la vista superior del espectro tridimensional SERS como un mapa de contorno (Figura 5B) para extraer los modos específicos asociados con una condición de pH particular (es decir, ~pH 4 y ~pH 10). Extraiga las características espectrales mejoradas para solo npares o solo nimpares.</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Péptido beta amiloide 1-40 (A y beta; 1&ndash; 40 péptido)</td><td>r-Péptido (Bogart, GA, EE. UU.)</td><td>A-1156-2</td><td></td></tr><tr><td>Cámara digital</td><td>CCD AMT</td><td>XR-40 4 megapíxeles CCD&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada desionizada del sistema de agua Milli-Q</td><td>Millipore Sigma (Burlington, MA, EE. UU.)</td> <td>Milli-Q IQ 7000</td><td></td></tr><tr><td>Freezer -86 oC</td><td>Thermo Scientific</td><td>Revco Chilly Willy&nbsp; ID de unidad de la serie RLE 187004 Número de compilación 40.04</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (10 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15703-20</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (100 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15711-22</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (15 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15704-20</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (20 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15705-20</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (30 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15706-21</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (40 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15707-21</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (50 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15708-21</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (60 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15709-22</td><td></td></tr><tr><td>Coloide de oro (80 nm)</td><td>Ted Pella, Inc. (Redding, California, EE. UU.)</td><td>15710-22</td><td></td></tr><tr><td>Discos de mica V1AFM de mayor grado 10 mm</td><td>Ted Pella Inc.</td><td>#50</td><td></td></tr><tr><td>Solución estándar de ácido clorhídrico, lote</td><td>Fluka</td> 1.0 <td>N# SHBB4705V&nbsp; &nbsp; &nbsp; &nbsp; 318949-2L</td><td></td></tr><tr><td>Macro cuarzo quvette Light Path 10 mm</td><td>Fire Fly Science&nbsp;</td><td>Tipo1-MC-PathMicro</td> electrodo de pH de 10 mm <td></td></tr><tr><td></td><td>HORIBA</td><td>Modelo 9618S (MFG No. 9Y8E0050)</td><td></td></tr><tr><td>Programa Peak Fit</td><td>Origin (Northampton, MA, EE. UU.)</td> <td>OrigenPro2018b (64 bits) b9.5.5.409 (Académico)</td><td></td></tr><tr><td>pH 4.00 Solución tampón&nbsp;</td><td>VWR</td><td>Cat No. 34170-127</td><td></td></tr><tr><td>pH 7.00 Solución tampón&nbsp;</td><td>Fisher Chemical</td><td>SB107-4 Lote 191041</td><td></td></tr><tr><td>medidor de pH</td><td>HORIBA</td><td>Modelo F-72G (MFG No. B27M0017)</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta &nbsp; Maxi Puntas 1&ndash; 5</td><td>mL Fisher&nbsp; &nbsp;</td><td>02-707-467</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 10 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-135</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 1000</td><td>mL Fisher</td><td>02-717-156</td><td></td></tr><tr><td>Puntas de pipeta 1&ndash; 200 mL</td><td>Fisher</td><td>02-717-143</td><td></td></tr><tr><td>Pipeta Fisher Brand Elite 0.5&ndash; 5 mL</td><td>Pipeta Fisher</td><td>QU05317</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite 100&ndash; 1000 mL</td><td>Pipeta Fisher</td><td>QU01672</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite 10&ndash; 100 mL</td><td>Pipeta Fisher</td><td>MU10985</td><td></td></tr><tr><td>Fisher Brand Elite 1&ndash; 10 mL</td> de <td>Fisher</td><td>MU08178</td><td></td></tr><tr><td>Solución de Hidróxido de Sodio 1.0 M</td><td>Fluka</td><td>Lote#05096BPV&nbsp; &nbsp; 319511-2L</td><td></td></tr><tr><td>TEM</td><td>FEI Co</td><td>Morgagni modelo 268&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>TempAssure Tubos de PCR, tapones planos, naturales&nbsp;</td>Polipropileno <td></td><td>científico de EE. UU</td><td>. Tubos individuales de pared delgada de 0,2 mL con tapas planas esmeriladas adjuntas</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis-NIR</td><td>Varian CARY</td><td>5000 UV1106M074</td><td></td></tr><tr><td>WI Tec alpha300R Microscopio Raman Confocal</td><td>WITec-Oxford Instrument</td><td>XMB3000-3001</td><td></td></tr></tbody></table>

caracterización del autoensamblaje reversible dependiente del ph de coloides de oro recubiertos de beta amiloide 1-40

Characterization of pH-Dependent Reversible Self-Assembly of Amyloid Beta 1-40-Coated Gold Colloids

Con la unión de Aβ 1-40 a la superficie de las partículas nanocoloidales de oro, la banda SPR alrededor del máximo de absorción de 530 nm se desplazó significativamente hacia el rojo hasta la posición máxima de ~650 nm cuando la solución se hizo más ácida (pH 4)35. Junto con las imágenes TEM, identificamos que las características espectroscópicas observadas a pH 4 corresponden a la formación de los agregados coloidales de oro con conformación plausiblemente desplegada y en red con los monómeros Aβ 1-40 desplegados circundantes adsorbidos sobre la superficie de oro30. Observamos que los monómeros Aβ 1-40 vuelven a la conformación plegada en condiciones básicas (pH 10), lo que resulta en una deformación de los agregados de manera casi reversible. Este proceso cuasi-reversible fue evidente a partir de la alternancia del pico de banda promedio (<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">(n)), que cambió entre una longitud de onda más corta y más larga, y la morfología dispersa vs. agregada en imágenes TEM entre condiciones básicas (pH = 10) y ácidas (pH = 4). Se ha observado previamente que una parte del monómero Aβ 1-40 permanece desplegada incluso después de que la solución se haya revertido a las condiciones básicas36. El video 1 muestra el cambio de color dependiente del pH del coloide de oro desnudo Aβ 1-40 y 20 nm.
A modo de comparación, se llevó a cabo la investigación del lúpulo de pH de un coloide de oro desnudo de 20 nm (Figura 5C y D). A medida que avanzaba la operación de cambio de pH, mostró el crecimiento de la agrupación de los coloides de oro en la banda SPR, imágenes TEM e imágenes de luz blanca. Curiosamente, había varias líneas espectrales SERS que dependían de npares e impares. Por ejemplo, a npar (pH ~4), se observó intensivamente la línea a 275 cm-1, que se asignó como el modo asociado con Aun (n = 5, 6, 12, 16, 20, 58)37 o el modo de Au-Cl- ligando38. Por otro lado, para npar, a 1008 cm-1 se observó C-N str39 y CH2 wag39, CH2 deformación40 se observaron ampliamente a 1291 cm-1.
En contraste con la clara morfología de agregación reversible y dependiente del pH observada por imágenes de luz blanca, hubo diferencias relativamente sutiles en las características espectrales en el espectro SERS entre npares e impares. Como primera aproximación, la densidad de líneas espectrales en la región comprendida entre 250 cm-1 y 1750 cm-1 fue mayor para n pares que para nimpares. Las líneas espectrales en la región de la huella dactilar, 1250 cm-1 y 1750 cm-1 (bandas de amida I, II y III) para nodd mostraron características espectrales menos resueltas, lo que implica un ensanchamiento o un aumento en las densidades espectrales. En la Figura 6, se organizó un mapa de contorno que se muestra en la Figura 5B (Figura 6B) con las señales SERS a 761 cm-1 (rojo) y 1395 cm-1 (azul), representando los énfasis en npares e impares, respectivamente (Figura 6C). Como espectro SERS representativo para npares e impares, el espectro SERS en n = 7 (rojo) y n = 4 (azul) se muestra en la parte superior (Figura 6A). Con el fin de mostrar la correspondencia con el cambio de banda SPR para Aβ1-40 recubierto de oro de 20 nm, el gráfico de cambio de banda en la Figura 3 se muestra en el lateral (Figura 6D).
Si bien tenemos datos preliminares sobre la asignación completa del espectro SERS observado, observamos aquí varias características notables de cambio Raman. Las líneas espectrales y (asignaciones plausibles) aumentadas en nimpares se encuentran principalmente en la región inferior a 1000 cm-1: 394 cm-1 (Trp)41,42,43, 761 cm-1 (His, Ala)39,44,45,46,47, 875 cm-1 (desplazamiento de NH indol, estiramiento C-C de Met)39, 974 cm-1 (Glu, C-COO- estiramiento del áspid, modo asociado al citrato)39,48,49. El desplazamiento Raman mejorado en nincluso mostró características espectroscópicas significativas en la región de la huella dactilar (Amida I, II y III): 1166 cm-1 (deformación N-H+ de Tyr)39,41, 1227 cm-1 (Ala-Pro-Gly, Amide III)39,50,51, 1395 cm-1 (COO- estiramiento simétrico o CH2- CH3- tijera de Glu)39,48, 1585 cm-1 (estiramiento del anillo CC de Phe, estiramiento asimétrico del carboxilato -Au, COO- estiramiento del citrato, deformación del anillo de benceno)39,41,45,46,47,49,52, 1592 cm-1 (Phe, Tyr, C=C estiramiento de Tyr, estiramiento CC del anillo en Phe, estiramiento del anillo de benceno y COO- estiramiento en Phe y Tyr, y estiramiento asimétrico de OH)39,41,48,50,51 y 1628 cm-1 (subpico de amida I distintivo para estructuras intermoleculares de β láminas53, C=O y los modos vibracionales CN/NH acoplados de la columna vertebral de la proteína que se originan en estructuras paralelas de tipo β lámina, acumulación de Aβ 54 agregado, bobinas aleatorias, β vueltas, horquillas de β48. Las secuencias que aparecen para n pares oimpares se muestran en la Figura 7. En general, para nincluso correspondiente a la agregación reversible o conformación desplegada de Aβ 1-40, el anillo que contiene benceno Phe/Tyr, el estiramiento simétrico de COO-, el modo de tijera CH2- CH3- de Glu y la deformación -NH+ de Tyr estuvieron significativamente involucrados en el cambio conformacional del péptido. Durante el desensamblaje de la agregación que se observó cuando los péptidos adoptaron la conformación plegada correspondiente a los modos prominentes en nimpar, Glu, Asp, Met, His y Ala parecieron estar involucrados.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig01.jpg"> 
Figura 1: Absorbancia y morfología dependientes del pH. Se muestra el espectro de absorción a pH 4 (A) y pH 10 (B) para nanopartículas de oro recubiertas de Aβ 1-40 (20 nm), y las correspondientes imágenes TEM, bocetos de agregación/partículas dispersas e imágenes de soluciones en viales. A es la conformación desplegada de los monómeros Aβ 1-40 en condiciones ácidas, y B es la conformación plegada en condiciones básicas. Junto a las imágenes TEM se muestran diagramas de monómeros Aβ 1-40 en cada conformación y morfologías de agregación/dispersión. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig02.jpg"> 
Figura 2: Reversibilidad del autoensamblaje dependiente del tamaño nanométrico. El desplazamiento de la posición media del pico de la banda SPR, <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;">, en función del número de operación, n, para todos los tamaños probados de partículas coloidales de oro. También se dan los valores aproximados de pH y la etapa correspondiente de los agregados que se muestran en la Figura 1 . <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig03v2.jpg"> 
Figura 3: <img alt="Equation 5" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq05.jpg" style="margin: auto;"> e imágenes TEM/luz blanca en cada número de operación. El <img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67856/67856eq02.jpg" style="margin: auto;"> número en función de la operación, n, se trazó conjuntamente para Aβ 1-40 recubierto de oro de 20 nm (círculos cerrados) y coloide de oro de 20 nm (círculos abiertos) y se muestra con imágenes representativas de TEM (A y C)/luz blanca (B y D) en números de operación seleccionados (n = 1, 2, 3, 7 y 8 marcados con flechas decodificadas) para Aβ 1-40 recubierto de oro de 20 nm (A y B) y coloide de oro de 20 nm (C y D). La fuente negra indica pH 7, la fuente azul indica pH 4 y la fuente roja indica pH 10. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig04.jpg"> 
Figura 4: Luz blanca representativa e imagen Raman. La imagen de luz blanca, la imagen Raman y el espectro SERS para (A) n = 2 y (B) n = 3; i) imagen de luz blanca en un campo de visión amplio, ii) imagen de luz blanca en el área donde se recogió la imagen Raman (etiquetada con un cuadrado rojo en i)), iii) la imagen Raman de dos componentes combinados, iv) imagen Raman del componente 1 y su v) espectro SERS de iv), vi) imagen Raman del componente 2, y vii) espectro SERS de vi). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig05.jpg"> 
Figura 5: Mapa de contorno del espectro SERS para nimpar, npar y ntodo. (A) El mapa tridimensional del espectro SERS en la región de 250 cm-1 y 1750 cm-1 en función de n para Aβ1-40 recubierto de oro de 20 nm con un mapa de contorno que se muestra en (B) en la parte superior. (C) El mapa tridimensional del espectro SERS en la región de 250 cm-1 y 1750 cm-1 en función de n para 20 nm de oro con un mapa de contorno mostrado en (D) en la parte superior. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig06v2.jpg"> 
Figura 6: Mapa de contorno del espectro SERS. Mapa de contorno del espectro SERS en función de n (1-10). (A) Absorbancia a 1395 cm-1 (azul) y 761 cm-1 (rojo). (B-D) El panel inferior muestra el espectro SERS y el panel derecho muestra la amplitud del cambio de intensidad de la señal SERS en cada n. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig06largev2.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 7" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67856/67856fig07v3.jpg"> 
Figura 7: Secuencias notables de Aβ1-40. Las secuencias asignadas para tener una participación significativa en npar (correspondientes a la formación de la conformación plegada) se indican con flechas rojas hacia abajo, y las asignadas para tener una participación significativa en npar (correspondientes a la formación de la conformación desplegada) se indican con flechas azules. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/67856fig07largev3.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Video 1: Cambio de color dependiente del pH de Aβ1-40 y coloide de oro desnudo de 20 nm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67856/Movie%20Abeta-Gold%20Color%20Change.wmv" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este video.</a>

Caracterización del autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos de beta amiloide 1-40

The characterization of A&#946;1-40 coated over the nano-gold colloidal particle surfaces was conducted using surface plasmon resonance (SPR) spectroscopy ...

characterization-ph-dependent-reversible-self-assembly-amyloid-beta-1

Research

Investigación

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

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Las proteínas pueden adoptar una estructura nativa o plegarse erróneamente en amiloide insoluble. Las condiciones que favorecen la vía de plegamiento incorrecto conducen a la formación de diferentes tipos de fibrillas amiloides. Los métodos aquí descritos permiten la rápida conversión de proteínas nativas en amiloide in vitro.

Rápida generación de amiloide a partir de proteínas nativas in vitro

Aquí nos presenta un protocolo de purificación por HPLC a medida que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 (? 42) y beta amiloides 40 (AP40), apto para la formación de oligómeros. El amiloide beta es un péptido altamente propensos agregación, hidrófoba implicada en la enfermedad de Alzheimer. La naturaleza del péptido amiloidogénico hace su purificación un desafío.

Un protocolo de purificación HPLC Tailored que los rendimientos de alta pureza beta amiloide 42 y 40 péptidos beta amiloide, capaz de Formación de oligómeros

Este protocolo describe cómo preparar oligómeros de Aß de un péptido sintético en vitro y evaluar cantidades relativas de oligómero Aβ mediante un punto de análisis el borrar.

A11-positivo β-amiloide oligómero preparación y evaluación mediante Dot blot análisis

Un protocolo para la síntesis de un 1, 2-dithiolane modificada de péptidos y la caracterización de las estructuras supramoleculares resultantes del peptide uno mismo-Asamblea.

Síntesis y caracterización de 1, 2-Dithiolane modifican uno mismo-montaje de péptidos

Presentados aquí son dos métodos que pueden utilizarse individualmente o en combinación para analizar el efecto de beta-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina. Incluido es un protocolo para crear un coágulo de fibrina en vitro , y después coágulo turbidez y microscopía electrónica métodos.

Análisis de anomalías inducida por β-amiloide en la estructura del coágulo de fibrina por espectroscopía y microscopía electrónica de barrido

Este método de purificación bioquímica con análisis proteómico basado en espectrometría de masas facilita la caracterización robusta de los núcleos de fibrilla amiloide, lo que puede acelerar la identificación de objetivos para prevenir la enfermedad de Alzheimer.

Purificación bioquímica y caracterización proteómica de núcleos de fibrillas amiloides del cerebro

Las fibrillas amiloides se forman por numerosas proteínas, y las fibrillas resultantes comparten una estructura de "β de lámina cruzada". Aquí describimos cómo se pueden preparar muestras de fibrilla amiloide para la difracción de fibras de rayos X y cómo pueden analizarse los patrones.

Amyloide y la arquitectura Cross-Beta

Aprende a caracterizar el autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos con beta amiloide 1-40. Este método utiliza espectroscopía SERS para estudiar cambios conformacionales y agregación de proteínas implicadas en la enfermedad de Alzheimer.

Caracterización del autoensamblaje reversible dependiente del pH de coloides de oro recubiertos de beta amiloide 1-40

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