Name: Uso de ensamblaje in vivo para la construcción de plásmidos de alta eficiencia (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:30:00.000+00:00
Duration: 6 min 25 s
Description: Aprende el ensamblaje in vivo para clonar ADN con alta eficiencia en E. coli. Este método elimina enzimas especializadas, reduce costos y acelera la construcción de plásmidos para estudios genéticos.

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<ol><li>Bertero, A., Brown, S., Vallier, L. Methods of cloning. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aBertero%2C+A+%22Basic+Science+Methods+for+Clinical+Researchers%22">Basic Science Methods for Clinical Researchers</a>. Chapter 2, Academic Press. 19-39 (2017).</li>
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<li>Sambrook, J., Fritsch, E. F., Maniatis, T. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aSambrook%2C+J+%22Molecular+cloning%3A+a+laboratory+manual%22">Molecular cloning: a laboratory manual</a>. , Cold Spring Harbor Laboratory Press. (1989).</li>
<li>Engler, C., Marillonnet, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Golden+Gate+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Golden Gate cloning.</a> Methods Mol Biol. 1116, 119-131 (2014).</li>
<li>Ma, H., Kunes, S., Schatz, P. J., Botstein, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmid+construction+by+homologous+recombination+in+yeast%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Plasmid construction by homologous recombination in yeast.</a> Gene. 58 (2-3), 201-216 (1987).</li>
<li>Cao, P., Wang, L., Zhou, G., Wang, Y., Chen, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rapid+assembly+of+multiple+DNA+fragments+through+direct+transformation+of+PCR+products+into+E.+coli+and+Lactobacillus%5BTitle%5D)+AND+%22Plasmid%22%5BJournal%5D)">Rapid assembly of multiple DNA fragments through direct transformation of PCR products into E. coli and Lactobacillus.</a> Plasmid. 76, 40-46 (2014).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Deletion+and+rearrangement+of+plasmid+DNA+during+transformation+of+Escherichia+coli+with+linear+plasmid+molecules%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Deletion and rearrangement of plasmid DNA during transformation of Escherichia coli with linear plasmid molecules.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8905-8917 (1986).</li>
<li>Conley, E. C., Saunders, V. A., Jackson, V., Saunders, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mechanism+of+intramolecular+recyclization+and+deletion+formation+following+transformation+of+Escherichia+coli+with+linearized+plasmid+DNA%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Mechanism of intramolecular recyclization and deletion formation following transformation of Escherichia coli with linearized plasmid DNA.</a> Nucleic Acids Res. 14 (22), 8919-8932 (1986).</li>
<li>Sung, W. L., Zahab, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Site-specific+recombination+directed+by+single-stranded+crossover+linkers%3A+specific+deletion+of+the+amino-terminal+region+of+the+beta-galactosidase+gene+in+pUC+plasmids%5BTitle%5D)+AND+%22DNA%22%5BJournal%5D)">Site-specific recombination directed by single-stranded crossover linkers: specific deletion of the amino-terminal region of the beta-galactosidase gene in pUC plasmids.</a> DNA. 6 (4), 373-379 (1987).</li>
<li>Mandecki, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Oligonucleotide-directed+double-strand+break+repair+in+plasmids+of+Escherichia+coli%3A+a+method+for+site-specific+mutagenesis%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Oligonucleotide-directed double-strand break repair in plasmids of Escherichia coli: a method for site-specific mutagenesis.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 83 (19), 7177-7181 (1986).</li>
<li>Jones, D. H., Howard, B. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+rapid+method+for+recombination+and+site-specific+mutagenesis+by+placing+homologous+ends+on+DNA+using+polymerase+chain+reaction%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">A rapid method for recombination and site-specific mutagenesis by placing homologous ends on DNA using polymerase chain reaction.</a> Biotechniques. 10 (1), 62-66 (1991).</li>
<li>Kostylev, M., Otwell, A. E., Richardson, R. E., Suzuki, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cloning+should+be+simple%3A+Escherichia+coli+DH5alpha-mediated+assembly+of+multiple+DNA+fragments+with+short+end+homologies%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Cloning should be simple: Escherichia coli DH5alpha-mediated assembly of multiple DNA fragments with short end homologies.</a> PLoS One. 10 (9), e0137466(2015).</li>
<li>Chen, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simplified+plasmid+cloning+with+a+universal+MCS+design+and+bacterial+in+vivo+assembly%5BTitle%5D)+AND+%22BMC+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Simplified plasmid cloning with a universal MCS design and bacterial in vivo assembly.</a> BMC Biotechnol. 21 (1), 24(2021).</li>
<li>Braun, H. G., Kanwal, N., Rivera Lopez, L. F., Thomassin, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Generation+of+a+plasmid+series+for+rapid+sub-cloning+and+use+in+various+Enterobacteriaceae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biosci+Bioeng%22%5BJournal%5D)">Generation of a plasmid series for rapid sub-cloning and use in various Enterobacteriaceae.</a> J Biosci Bioeng. 138 (6), 478-487 (2024).</li>
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<li>Wallace, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Hybridization+of+synthetic+oligodeoxyribonucleotides+to+phi+chi+174+DNA%3A+the+effect+of+single+base+pair+mismatch%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Hybridization of synthetic oligodeoxyribonucleotides to phi chi 174 DNA: the effect of single base pair mismatch.</a> Nucleic Acids Res. 6 (11), 3543-3557 (1979).</li>
<li>Bzymek, M., Lovett, S. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Instability+of+repetitive+DNA+sequences%3A+The+role+of+replication+in+multiple+mechanisms%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+USA%22%5BJournal%5D)">Instability of repetitive DNA sequences: The role of replication in multiple mechanisms.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 98 (15), 8319-8325 (2001).</li>
<li>Lee, P. Y., Costumbrado, J., Hsu, C. -Y., Kim, Y. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Agarose+gel+electrophoresis+for+the+separation+of+DNA+fragments%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Agarose gel electrophoresis for the separation of DNA fragments.</a> J Vis Exp. (62), e3923(2012).</li>
<li>Sambrook, J., Russell, D. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+inoue+method+for+preparation+and+transformation+of+competent+E.+coli%3A+%26%2334%3Bultra-competent%26%2334%3B+cells%5BTitle%5D)+AND+%22CSH+Protoc%22%5BJournal%5D)">The inoue method for preparation and transformation of competent E. coli: &#34;ultra-competent&#34; cells.</a> CSH Protoc. 2006 (1), (2006).</li>
<li>Froger, A., Hall, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transformation+of+plasmid+DNA+into+E.+coli+using+the+heat+shock+method%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Transformation of plasmid DNA into E. coli using the heat shock method.</a> J Vis Exp. (6), e253(2007).</li>
<li>Fürste, J. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Molecular+cloning+of+the+plasmid+RP4+primase+region+in+a+multi-host-range+tacP+expression+vector%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Molecular cloning of the plasmid RP4 primase region in a multi-host-range tacP expression vector.</a> Gene. 48 (1), 119-131 (1986).</li>
<li>Bäumler, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Identification+of+a+new+iron+regulated+locus+of+Salmonella+typhi%5BTitle%5D)+AND+%22Gene%22%5BJournal%5D)">Identification of a new iron regulated locus of Salmonella typhi.</a> Gene. 183 (1-2), 207-213 (1996).</li>
<li>Godiska, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Linear+plasmid+vector+for+cloning+of+repetitive+or+unstable+sequences+in+Escherichia+coli%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">Linear plasmid vector for cloning of repetitive or unstable sequences in Escherichia coli.</a> Nucleic Acids Res. 38 (6), e88(2010).</li>
<li>Watson, J. F., Garcia-Nafria, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In+vivo+DNA+assembly+using+common+laboratory+bacteria%3A+A+re-emerging+tool+to+simplify+molecular+cloning%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">In vivo DNA assembly using common laboratory bacteria: A re-emerging tool to simplify molecular cloning.</a> J Biol Chem. 294 (42), 15271-15281 (2019).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb Plus escalera de ADN</td><td>FroggaBio</td><td>DM015-R500 Marcador de</td><td>peso molecular de ADN</td></tr><tr><td>AccuReady M Monocanal 0.5-10 &micro; L Bulldog</td><td>Bio</td><td>BPP020</td><td>Pipetas para la transferencia de líquidos</td></tr><tr><td>AccuReady M Kit de pipetas de un solo canal</td><td>Bulldog Bio</td><td>BPK100</td><td>Pipetas para la transferencia de líquidos</td></tr><tr><td>Agar BioShop</td><td>Canada</td><td>AGR003.1</td><td>Agente solidificante para el medio de crecimiento</td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biobasic</td><td>D0012</td><td>Hacer geles de agarosa para electroforesis de ADN</td></tr><tr><td>Biometra TOne&nbsp;</td><td>Analytikjena</td><td>846-2-070-301</td><td>Tapas termocicladoras</td></tr><tr><td>para tubos de cultivo de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-957-91</td><td>Tapones reutilizables para tubos de cultivo de vidrio</td></tr><tr><td>cebadores de ADN</td><td>Tecnologías de ADN integradas</td><td>N/A</td><td>Unir y amplificar el ADN molde en la reacción de PCR</td></tr><tr><td>DpnI&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>R0176S</td><td>Escinde el ADN molde metilado después de la amplificación por PCR</td></tr><tr><td>EcoRI</td><td>New England Biolabs</td><td>R3101L</td><td>Enzima de restricción, viene con el tampón adecuado</td></tr><tr><td>Microtubos Eppendorf 1,5 mL</td><td>Microtubo Sarstedt</td><td>72.690.300</td>, <td>1,5 mL, base cónica, PP, tapa plana adjunta, graduaciones moldeadas y espacio de escritura esmerilado</td></tr><tr><td>Bromuro de etidio</td><td>Fisher Scientific</td><td>AAL0748203</td><td>Agente de visualización/intercalación de ADN, tóxico</td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de ADN plasmídico de columna de espín EZ-10</td><td>Biobasic</td><td>BS614</td><td>Aísla el ADN plásmido de cultivos bacterianos durante la noche</td></tr><tr><td>Sistema GelDoc Go-Gel</td><td>Bio-Rad</td><td>12009077</td><td>Imaging Geles de ADN</td></tr><tr><td>Tubos de cultivo de vidrio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-925E</td><td>Tubos de cultivo de vidrio</td></tr><tr><td>myGel&nbsp; Mini sistema de electroforesis</td><td>Sigma-Aldrich</td><td></td><td>Z742288 sistema utilizado para la electroforesis en gel</td></tr><tr><td>NanoDrop One</td><td>Thermo</td><td>Fisher ND-ONE-W</td><td>Determine la concentración de ADN</td></tr><tr><td>Limpieza de PCR para secuenciación de ADN</td><td>Biobasic</td><td>BT5100</td><td>Purify PCR products&nbsp;</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Sarstedt</td><td>82.1473.011</td><td>Placa de Petri 92 x 16 mm, PS, transparente, con levas de ventilación</td></tr><tr><td>Punta de pipeta, 1000 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.305</td><td>Puntas de pipeta para 100-1000 y micro; L</td></tr><tr><td>Punta de pipeta, 2,5 y micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3010.265</td><td>Puntas de pipeta para hasta 2,5 y micro; L</td></tr><tr><td>Punta de pipeta, 20 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3020.200</td><td>Puntas de pipeta para hasta 20 &micro; L</td></tr><tr><td>Punta de pipeta, 200 &micro; L</td><td>Sarstedt</td><td>70.3030.020</td><td>Puntas de pipeta para 1-200 y micro; L</td></tr><tr><td>Sal (NaCl)</td><td>Fisher Scientific</td><td>S271-10</td><td>Componente del medio de crecimiento bacteriano (10 g/L)</td></tr><tr><td>Tubos individuales de PCR de 0,2 mL con tapa plana</td><td>FroggaBio</td><td>TF-1000</td><td>Tubos de PCR</td></tr><tr><td>Triptona (bacteriológica)</td><td>BioShop Canada</td><td>TRP402.5</td><td>Componente del medio de crecimiento bacteriano (10 g/L)</td></tr><tr><td>VeriFi ADN polimerasa</td><td>PCR Biosystems</td><td>PB10.42-01</td><td>La polimerasa de alta fidelidad, el tampón PCR que contiene Mg2+ y dNTPs se proporciona con la compra</td></tr> <tr><td>Xba I</td> Enzima de restricción <td>R0145S</td> de <td>New England Biolabs</td><td>, viene con el tampón adecuado</td></tr><tr><td>Extracto de levadura</td><td>BioShop Canada</td><td>YEX401.205</td><td>Componente del medio de crecimiento bacteriano (5 g/L)</td></tr></tbody></table>

uso de ensamblaje in vivo para la construcción de plásmidos de alta eficiencia

Use of In Vivo Assembly for High-efficiency Plasmid Construction

En este manuscrito, como ejemplo del uso de IVA, seguimos el flujo de trabajo de IVA proporcionado para volver a clonar el marco de lectura abierto mCherry en el sitio de clonación múltiple del plásmido pSU19 para generar un plásmido idéntico a pSU19mCherry (Figura 3)17. Los cebadores adecuados para IVA se diseñaron con base en los pasos 1.1 y 1.2 del protocolo. A continuación, se utilizó un kit de aislamiento de plásmidos para aislar pSU19 y pSU18mCherry, que sirvier...

Uso de ensamblaje in vivo para la construcción de plásmidos de alta eficiencia

In vivo assembly (IVA) is a molecular cloning method that uses intrinsic enzymes present in bacteria that promote intermolecular recombination of DNA ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Bioengineering

Bioingeniería

Un método rápido y eficiente para integrar ADN ajeno de interés en cepas aceptor pre-hechas, llamadas cepas pista de aterrizaje, se describe. El método permite específica del sitio de integración de un cassette de ADN en el locus de aterrizaje almohadilla de ingeniería de una cepa dada, a través de la conjugación y expresión de la integrasa ΦC31.

Sitio específico de Ingeniería cromosoma bacteriano: ΦC31 integrasa mediada Cassette Exchange (IMCE)

Fuente: Tomás, J. M., et al. Generación de mutantes nulos para dilucidar el papel de las glicosiltransferasas bacterianas en la motilidad bacteriana. J. Vis. Exp. (2022).Este video demuestra la amplificación dependiente del iniciador de un plásmido suicida en E. coli. El plásmido, que porta un gen de resistencia a los antibióticos, se replica solo en presencia de una proteína iniciadora codificada por el huésped. Después de la electroporación e incubación en medio de recuperación, la mezcla se...

Amplificación de un plásmido suicida en un huésped bacteriano

Las metodologías de selección de genes se pueden utilizar para generar ratones transgénicos con alelos knockout, knock-in y marcados.  Aquí, describimos un método mejorado de recombinación en E. coli, que denominamos 'subclonación más inserción', que se puede utilizar para generar rápidamente vectores de orientación génica personalizados.

Subclonación Plus Inserción (SPI) - Un nuevo método recombinería para la rápida construcción de la orientación de genes Vectores

La síntesis de plásmidos personalizados requiere trabajo y tiempo. Este protocolo describe el uso de la clonación de ensamblaje de Gibson para reducir el trabajo y la duración del procedimiento de clonación de ADN personalizado. El protocolo descrito también produce construcciones de proteínas marcadas confiables para la expresión en mamíferos a un costo similar al de la clonación tradicional de ADN de cortar y pegar.

Generación de plásmidos vectores que expresan proteínas de la bandera de etiquetado bajo la regulación del promotor factor de elongación humano-1α Usando Asamblea Gibson

Dominios de dedos de zinc son células permeable intrínseca y capaz de mediar la entrega de proteínas en una amplia gama de tipos de células de mamíferos. Aquí, se presenta un protocolo detallado paso a paso para la implementación de la tecnología zinc-finger para la entrega de proteínas intracelulares.

Proteína entrega directa de células de mamíferos Utilización de Células permeable Cys<sub&gt; 2</sub&gt; -Su<sub&gt; 2</sub&gt; Dominios de zinc-finger

Aquí, se presenta el ensamblaje de quimeras mediante la recuperación de plásmidos y la inserción en el sitio de enzima de restricción (CAPRRESI), un protocolo basado en la inserción de sitios de enzimas de restricción en secuencias de ADN sinónimas y recuperación funcional de plásmidos. Este protocolo es un método rápido y de bajo costo para fusionar genes codificadores de proteínas.

CAPRRESI: Ensamblaje de quimeras por inserción de sitios de enzimas de recuperación y restricción de plásmidos

Aquí, presentamos un protocolo para producir grandes cantidades de RNA recombinante en Escherichia coli Co expresando un ARN quimérico que contiene el ARN de interés en un andamio de Viroide y una planta de Arnt Ligasa. El principal producto es una molécula circular que facilita la purificación a homogeneidad.

Producción a gran escala de ARN recombinante en un andamio Circular utilizando un sistema derivado de Viroide en Escherichia coli

El objetivo de este protocolo es proporcionar una guía detallada paso a paso para el montaje de construcciones multigénicos utilizando el sistema de clonación modular basado en la clonación Golden Gate. También ofrece recomendaciones sobre pasos críticos para garantizar un montaje óptimo basado en nuestras experiencias.

Montaje rápido de construcciones multigénicas mediante clonación modular Golden Gate

Este artículo presenta un protocolo paso a paso que demuestra cómo se puede adaptar la clonación modular (MoClo) para la clonación de operones policistrónicos.

Ensamblaje modular estandarizado de operones policistrónicos con clonación modular (MoClo) utilizando el kit de herramientas In-Cloning

El estudio actual describe un flujo de trabajo para la secuenciación nanoporosa de plásmidos cuando la secuencia cromosómica ya se conoce o no tiene interés. Un paso inicial de enriquecimiento de ADN plasmidal asegura una profundidad óptima de secuencia plasmidal y maximiza el número de muestras que pueden secuenciarse por celda de flujo.

Secuenciación y ensamblaje de plásmidos de lectura larga utilizando flujos de trabajo basados en secuenciación nanopore

Aprende el ensamblaje in vivo para clonar ADN con alta eficiencia en E. coli. Este método elimina enzimas especializadas, reduce costos y acelera la construcción de plásmidos para estudios genéticos.

Uso de ensamblaje in vivo para la construcción de plásmidos de alta eficiencia

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