Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster

Nuestra investigación se centra en comprender cómo las células detectan, monitorean y regulan los múltiples loci de ADN ribosómico dentro de su genoma. Específicamente, nuestro objetivo es descubrir los mecanismos que distinguen qué loci de ADNr se transcriben activamente y cómo estos loci se regulan individualmente. Recientemente hemos descubierto que la cantidad de ADNr en una célula puede cambiar con el tiempo, y que este cambio altera los loci de ADNr que se transcriben.

Ahora entendemos que las células cambiarán su transcripción de ADNr en función de la cantidad de ADNr que tengan. Este descubrimiento nos lleva a preguntarnos cómo las células saben cuánta CDR tienen y cómo determinan qué locus de ADNr preferirán expresar. Nuestro laboratorio se centra ahora en comprender el mecanismo que utilizan las células para distinguir entre diferentes loci de ADNr y detectar y regular su actividad.

Bajo un microscopio estereoscópico, diseccione Drosophila para aislar los testículos en PBS libres de ARNasa. Para empezar, agarra la mitad del abdomen con un par de pinzas y el extremo del abdomen con otro par para separar suavemente al animal. Con pinzas, transfiera los testículos aislados de la placa de disección a un tubo de microfuga de 1,5 mililitros que contenga 0,5 mililitros de PBS sin ARNasa.

Aspirar el PBS y añadir un mililitro de solución de fijación. Coloque la muestra en un agitador nutante a temperatura ambiente durante 30 minutos. Después de la incubación, aspire la solución de fijación.

A continuación, lavar la muestra dos veces con un mililitro de PBS durante cinco minutos cada una en un agitador nutante. Después de aspirar el PBS, agregue un mililitro de etanol al 70% libre de RNasa e incube la muestra a cuatro grados centígrados durante la noche en un agitador nutante. A continuación, aspire el etanol y añada un mililitro de tampón de lavado a la muestra.

Incubar la muestra a temperatura ambiente en un agitador nutante durante tres minutos. Después de eso, deje que el tubo descanse en posición vertical durante dos minutos. Mezcle las sondas y las mascarillas con el tampón de hibridación para preparar un volumen total de 100 microlitros por muestra como se muestra aquí.

A continuación, añada 100 microlitros de solución de hibridación a la muestra después de aspirar el tampón de lavado. Aplique una película transparente para sellar los bordes del tubo. Envuelva el tubo en papel de aluminio para protegerlo de la luz e incube la muestra en un baño de agua a 37 grados centígrados durante al menos 24 horas.

Sin aspirar la solución de hibridación, agregue un mililitro de tampón de lavado a la muestra. Incubar la muestra en un baño de agua a 37 grados centígrados durante 30 minutos en la oscuridad. Una vez aspirado el tampón de lavado, se añade un mililitro de tampón de lavado fresco a la muestra y se vuelve a incubar.

Al final de la incubación, aspire el tampón de lavado y agregue 50 microlitros de medio de montaje a la muestra. Bajo un microscopio estereoscópico de disección, utilice una pipeta para transferir la muestra a un portaobjetos de microscopio. Con pinzas, coloque los testículos en una línea en el portaobjetos del microscopio para facilitar la identificación de la muestra durante la toma de imágenes.

Cubra la muestra con un cubreobjetos y seque los bordes del cubreobjetos con una toallita de papel para eliminar el exceso de medios de montaje. Sella los bordes del cubrebotas con esmalte de uñas y déjalos en la oscuridad a temperatura ambiente durante 10 minutos para permitir que el esmalte de uñas se seque. Se detectaron señales de ARNr en el nucléolo, que aparecen como regiones de poros DAPI dentro del núcleo, particularmente en células germinales con núcleos grandes y nucléolos.

Se observaron señales débiles e inespecíficas en el citoplasma en muestras que carecían de loci de ARNr. En la mayoría de las células, se detectaron exclusivamente señales de ARNy, lo que indica la transcripción del ARNr del locus de ADNy. Se observó la coexpresión de X e YrRNA en las células germinales, con señales que se fusionan en un solo núcleo o se separan en dos nucléolos.