Name: Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-28T14:50:00.000+00:00
Duration: 4 min 59 s
Description: Aprende a detectar transcritos de ARN ribosómico específicos del locus mediante FISH sensible a SNP en Drosophila melanogaster. Este método permite distinguir la transcripción de rDNA del cromosoma X e Y en células germinales.

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</ol>

<table><tbody><tr><td>PTC Tempo 96 Termociclador</td><td>Bio Rad</td><td>12015382</td><td>Se puede utilizar cualquier termociclador</td></tr><tr><td>0,2 mL 8 tiras de casquillo plano Tubos de PCR</td><td>VWR</td><td>89133-912</td><td>Se pueden utilizar todos los tubos compatibles Escalera de</td></tr><tr><td>ADN de 1 kb</td><td>NEB N3232S</td><td></td><td>Para usar cuando se verifica la secuenciación Tamaño del amplicón de PCR mediante electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga graduados de 1,5 mL</td><td>USA Scientific 1615-5510</td><td></td><td>Cualquier tubo certificado sin RNasa servirá</td></tr> para <tr><td>2 mM dNTP Mix</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R0241</td><td></td></tr><tr><td>50x TAE Buffer</td><td>Bio Rad</td><td>1610743</td><td>utilizado para la electroforesis en gel. Se puede utilizar cualquier tampón TAE.</td></tr><tr><td>5M NaCl</td><td></td><td></td><td>Cualquier NaCl puede ser utilizado o preparado a partir de cualquier fuente</td></tr><tr><td>Agarosa</td><td>VWR</td><td>97064-250</td><td>Cualquier Agarosa puede ser utilizada</td></tr><tr><td>ApE - Un plásmido Software editor</td><td>N/A</td><td>N/A</td><td></td></tr> https://jorgensen.biology.utah.edu/wayned/ape/ <tr><td>Esmalte</td><td></td><td></td> de uñas transparente <td>Se puede utilizar cualquier esmalte de uñas de cualquier minorista</td></tr><tr><td>Cubreobjetos, n.º 1 de espesor</td><td>Thomas Scientific</td><td>6672A38</td><td></td></tr><tr><td>Formamida desionizada</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC9569627</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de Dextrano Sigma Sódico</td><td>Aldrich</td><td>D8906-10G</td><td></td></tr><tr><td>DreamTaq Verde PCR Master Mix</td><td>Pinza ThermoFisher Scientific</td><td>K1081</td><td></td></tr><tr><td>Dumont #5</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td>Se utiliza para diseccionar muestras</td></tr><tr><td>EDTA (0,5 M), pH 8,0</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>R1021</td><td>Se puede utilizar cualquier producto comparable</td></tr><tr><td>Etanol</td><td>VWR</td><td>89125-172</td><td>Se puede utilizar cualquier etanol de 200 grados. Se utiliza para la dilución a etanol al 70% para la permeabilización y la limpieza en condiciones libres</td></tr><tr><td>de ARNasa Bromuro de etidio</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15585011</td><td></td></tr><tr><td>Sistema de electroforesis de gel mini gel horizontal</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-955-170</td><td>Se puede utilizar cualquier sistema de electroforesis en gel</td></tr><tr><td>Kimwipes</td><td>Fisher Scientific</td><td>06-666</td><td></td></tr><tr><td>Micro-Test Staining Dish</td><td>Electron Ciencias de la Microscopía</td><td>71564</td><td>Se utiliza para la disección de muestras</td></tr><tr><td>Agitador nutante</td><td>Sigma Aldrich</td><td>BMSB3D1020</td><td>Se puede utilizar cualquier agitador nutante</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>USA Scientific</td><td>3023-4526</td><td></td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato (10X) pH 7.4, libre de RNasa</td><td>Life Technologies</td><td>AM9624</td><td></td></tr><tr><td>Pierce 16% de formaldehído (w/v), sin metanol</td><td>Life Technologies</td><td>28908</td><td></td></tr><tr><td>Baño de agua de uso general de precisión</td><td>Life Technologies</td><td>TSGP02</td><td>Se puede utilizar cualquier baño de agua</td></tr><tr><td>QIAquick Kit de extracción de gel</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td>Se puede utilizar cualquier kit de extracción de gel</td></tr><tr><td>Solución de proteinasa K recombinante (20 mg/mL)</td><td>Invitrogen</td><td>AM2546</td><td>Se puede utilizar cualquier producto comparable</td></tr><tr><td>UltraPure BSA sin ARNasa</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>AM2618</td><td></td></tr><tr><td>S. cerevisiae ARNt</td><td>Sigma Aldrich</td><td>R8759</td><td></td></tr><tr><td>SSC (20X), libre de ARNasa</td><td>Fisher Scientific</td><td>AM9763</td><td></td></tr><tr><td>Triton-X 100</td><td>Life Technologies</td><td>A16046.AE</td><td></td></tr><tr><td>UltaPure 1M Tampón Tris-HCl, pH 7,5</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>15567027</td> Se <td>puede utilizar</td></tr> <tr><td>cualquier producto comparableAgua destilada ultrapura sin DNasa/RNasa</td><td>Life Technologies</td><td>10977023</td><td></td></tr><tr><td>Complejo de ribonucleósidos de vanadilo</td><td>NEB</td><td>S1402S</td><td></td></tr><tr><td>Medios de montaje VECTASHIELD con línea DAPI</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1200-10</td><td></td></tr><tr><td>VWR Superfrost Portaobjetos</td><td>VWR</td><td>48311-601</td><td></td></tr><tr><td>y[1]w[1] Drosophila melanogaster</td> <td>lineBloomington Drosophila Stock Center</td><td>1495</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal Zeiss LSM 980</td><td>Microscopía</td><td></td> Zeiss <td>Se puede utilizar cualquier microscopio confocal con emisión y detección compatibles</td></tr><tr><td>Microscopio estereoscópico Zeiss Stemi 2000-C y</td><td>microscopio de</td><td></td> fuente de luz Central <td>455053 Se puede utilizar cualquier microscopio estereoscópico</td></tr></tbody></table>

detección de fish sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de arn ribosómico específico del locus en drosophila melanogaster

Single Nucleotide Polymorphism-sensitive FISH Detection of Locus-specific Ribosomal RNA Transcription in Drosophila melanogaster

Se espera que los resultados de la secuenciación del genotipado de SNP detecten las diferencias de SNP entre los loci de ADNr X e Y. Estos SNPs se detectan evaluando directamente las posiciones de los SNPs en cromatogramas de secuenciación (Figura 2). Se espera que la secuenciación de muestras femeninas tenga una sola señal de secuenciación en la posición SNP, lo que indica la homocigosidad del SNP entre los dos cromosomas X (Figura 2A). Se espera que los resultados de la secuenciación de la muestra masculina tengan un doble pico en la posición del SNP (Figura 2B). Sobre la base del genotipo del cromosoma X determinado a partir de la secuenciación de la muestra femenina, se infiere que la variante no X es un SNP de ADNr del cromosoma Y (es decir, X = T, Y = C para la secuenciación del SNP 18S en la Figura 2). Alternativamente, un solo pico de secuenciación en una posición de SNP en la muestra masculina indicaría homocigosis entre los loci de ADNr masculinos y femeninos en esa posición de SNP, y esa posición no sería utilizable para los peces SNP de ARNr.
Siguiendo el protocolo para SNP FISH, las muestras se pueden visualizar montándolas en portaobjetos y colocándolas debajo de un cubreobjetos sellado, seguido de microscopía confocal. Utilizando las sondas enumeradas en la Tabla 3, la señal de ARNr derivada de Y es detectada por la emisión de Alexa Fluor 647 y la señal de ARNr derivada de X es detectada por la emisión de Alexa Fluor 488. Se espera que se observen señales de ARNr en el nucléolo, que puede identificarse como el agujero pobre en DAPI en el núcleo (Figura 3A). El nucléolo es particularmente fácil de identificar en las células germinales debido a su gran núcleo y nucléolo (Figura 3A). Por lo general, la señal débil también se puede encontrar en el citoplasma (Figura 3), pero esta es una señal inespecífica que también se puede detectar en muestras sin ARNr que contienen un SNP complementario (es decir, señal Y en células que carecen de ADNr Y o señal X en células que carecen de ADNr X; Figura 3B-C). Además, el co-marcaje artificial del ARNr X e Y puede detectarse a veces en el centro somático, incluso en muestras que carecen de loci de ADNr X o Y (Figura 3B-C, flechas amarillas). Por lo tanto, solo se deben utilizar señales nucleares para evaluar la transcripción específica del locus. Se espera que la mayoría de las células, particularmente las células somáticas, solo tengan una señal de ARNr Y, lo que indica que el ARNr se transcribe exclusivamente del locus ADNr Y (Figura 3A, círculo punteado amarillo y flecha roja)10,17. Sin embargo, la coexpresión de ARNr X e Y se detecta a menudo en las células germinales, particularmente en las células madre de la línea germinal13 (Figura 3A, círculos punteados blancos). Las señales de ARNr X e Y en las células que se expresan conjuntamente pueden ser adyacentes y formar un solo nucléolo (Figura 3A, celda superior) o pueden separarse, formando dos nucleolos (Figura 3A, celda inferior). Los ejemplos de la Figura 3 se proporcionan a partir de rDNA SNP-FISH utilizando conjuntos de sondas dirigidos solo a dos SNP (los dos SNP ITS1), lo que demuestra que solo se necesitan dos SNP para rDNA SNP-FISH. Sin embargo, se observan señales más robustas cuando se utilizan sondas dirigidas a los cuatro SNP13.
Los controles negativos son una inclusión importante para este ensayo para confirmar que las sondas no reaccionan de forma cruzada con el objetivo SNP incorrecto, especialmente cuando se soluciona el método por primera vez. Los controles negativos del cromosoma X incluyen cualquier afección que carezca de ADNr del cromosoma X, como los hombres que albergan un cromosoma X con una deleción de ADNr. Se espera que los controles negativos del cromosoma X solo detecten la señal de ARNr Y y no el ARNr X (Figura 3B). Los controles negativos del cromosoma Y incluyen cualquier afección que carezca de ADNr del cromosoma Y. Algunos ejemplos de estas condiciones son cualquier tejido femenino XX, tejido de hombres que carecen de un cromosoma Y o hombres que albergan un cromosoma Y con una deleción de ADNr15. Se espera que los controles negativos del cromosoma Y solo detecten la señal de ARNr X y no tengan ninguna señal de ARNr Y detectable (Figura 3C). Tenga en cuenta que estos controles no solo son importantes para determinar la especificidad de la sonda, sino también para determinar cualquier fondo o artefacto de la señal. Cualquier nueva sonda o condición de ensayo que proporcione especificidad en dichos controles se puede utilizar con precisión para detectar la transcripción de ADNr específica del locus.
Diferentes condiciones genéticas, de desarrollo o ambientales pueden alterar la probabilidad de que el ADNr se transcriba exclusivamente del locus 13,17 del ADNr del cromosomaY. La frecuencia de transcripción del ADNr de un solo locus o de múltiples loci se puede cuantificar y comparar directamente entre muestras. Con el fin de comparar cuantitativamente las diferencias en la transcripción del locus del ADNr, cada célula debe clasificarse individualmente como Y-dominante, Co-dominante o X-dominante. Las celdas solo se clasifican como dominantes Y y X si solo se detecta esa señal respectiva. Cualquier célula con señales de ARNr Y y X se considera codominante, incluso si una señal es mucho más débil que la otra. Por lo tanto, las células que contienen señales X e Y muy fuertes se consideran cualitativamente iguales a las células con señales Y fuertes y X débiles o X fuertes e Y débiles. El porcentaje total de todas las células en todas las muestras de cada categoría se puede comparar entre muestras mediante la prueba de chi cuadrado. Si bien este ensayo funciona bien para determinar cualitativamente si un locus de ADNr en particular se transcribe o no, no hemos observado evaluaciones consistentes entre muestras al cuantificar directamente la intensidad de fluorescencia de las señales SNP-FISH individuales. Por lo tanto, no recomendamos realizar evaluaciones cuantitativas de la intensidad de la señal FISH entre muestras o la intensidad relativa de las señales de ADNr X e Y dentro de una sola célula. La fuente de esta inconsistencia en la intensidad de la fluorescencia no está clara, aunque puede deberse a la unión ineficiente de las sondas enmascaradas que no se unen a todos los ARNr objetivo.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama del método SNP-FISH. (A) Las sondas de oligonucleótidos antisentido FISH tradicionales reaccionan de forma cruzada con ARN no objetivo que difieren en un solo nucleótido. (B) El método SNP-FISH utiliza oligonucleótidos de máscara complementaria unidos a la región 3' de la sonda de oligonucleótidos. La máscara deja solo 10 nucleótidos libres para unirse a la secuencia objetivo. Una región de sonda no enmascarada no se une de manera estable a secuencias no objetivo que difieren en uno o más nucleótidos. La máscara se disocia de la sonda después de que la sonda se une al objetivo, lo que permite una unión estable entre la sonda y el objetivo. (C) Las sondas SNP emparejadas etiquetadas de manera diferente combinadas con una máscara común se unen específicamente a objetivos que difieren en un solo nucleótido sin reacciones cruzadas. (D) Se pueden agrupar múltiples sondas para etiquetar específicamente distintos haplotipos de ARNr. Se han caracterizado cuatro diferencias de SNP entre los loci de ADNr X e Y en la cepa y1w1 de Drosophila melanogaster . Un SNP en el ARNr 18S, uno en el ARNr 28S y dos en la porción ITS1 del pre-ARNr. Se muestran los haplotipos de ARNr específicos de X e Y utilizados para SNP-FISH. Las sondas dirigidas a la variante de ADNr X en los cuatro SNP de ARNr se conjugan con un fluoróforo común (verde), y las sondas dirigidas a las variantes de ADNr Y se conjugan con un fluoróforo diferente (magenta). Se utiliza una mascarilla común para cada SNP (cuatro en total). La unión de sondas específicas de SNP en cada posición de SNP en el ARNr puede etiquetar específicamente el ARNr de los loci de ADNr X e Y con hasta cuatro sondas de oligonucleótidos FISH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig02.jpg"> 
Figura 2: Ejemplos de resultados de secuenciación de SNP de ADNr homocigotos y heterocigotos. Ejemplo: cromatogramas de secuenciación a partir de secuenciación de ADN SNP 18S de muestras de (A) hembras y (B) machos. Posición SNP 18S indicada con un asterisco (*). La señal única de timina (T) para la posición del SNP en la muestra femenina indica una timina en la posición del SNP en el locus del ADNr del cromosoma X. La doble señal en la posición del SNP dividida entre timina y citosina (C) en la muestra masculina indica una citosina en la posición del SNP en el locus del ADNr del cromosoma Y (inferida al saber que la timina está en el locus del cromosoma X). Los resultados de la secuenciación se observaron utilizando ApE, un software editor de plásmidos19. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67881/67881fig03.jpg"> 
Figura 3: Ejemplos de resultados de SNP-FISH en el testículo de Drosophila utilizando solo dos conjuntos de sondas SNP-FISH. Ejemplos de SNP FISH en los testículos de animales con (A) ADNr X e Y, (B) solo ADNr Y, o (C) solo ADNr X. En estos ejemplos solo se utilizaron conjuntos de sondas que marcaron los dos SNP de ARNr ITS1, lo que demuestra que el ARNr SNP FISH funciona con tan solo dos SNP objetivo. Las células germinales se identifican por su núcleo grande y redondo y las células somáticas por su núcleo más pequeño y menos redondo. Las células madre de la línea germinal se identifican por su posición directamente al lado del centro somático, marcada con un asterisco (*). Las células germinales que transcriben el ADNr de los loci de ADNr X e Y se identifican mediante señales FISH nucleares X e Y (círculos punteados blancos, A-A''). Las células germinales que transcriben ADN solo del locus Y rDNA solo tienen una señal FISH nuclear Y (círculo punteado amarillo). Las células somáticas que solo expresan Y están marcadas con una flecha roja. Se puede observar el co-marcaje artificial de los loci de ADNr X e Y en el eje somático (flecha amarilla). La barra de escala es de 10 μm. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/67881fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Archivo suplementario 1: Secuencia de ARNr del locus del cromosoma X. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67881/Dm_45S_rRNA.zip" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster

In order to ensure sufficient ribosomal RNA (rRNA) is transcribed for ribosome function, genomes contain hundreds of tandem duplications of the sequences ...

single-nucleotide-polymorphism-sensitive-fish-detection-locus

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La Purificación de Afinidad de Ribosoma Traductora (TRAP) es capaz de capturar la traducción específica del tipo de célula del ARNm. Aquí informamos sobre el primer protocolo TRAP dedicado al aislamiento de ARNm en poblaciones celulares raras de embriones de Drosophila.

TRAP-rc, Traducción ribosoma Affinity Purificación de poblaciones de células raras de<em&gt; Drosophila</em&gt; Los embriones

El RNA se describe en situ hibridación protocolo permite la detección de RNA en todo Drosophila embriones o tejidos disecados. Utilizando placas de microtitulación de 96 pocillos y amplificación de la señal tyramide, transcripciones pueden ser detectadas en el rendimiento, sensibilidad y alta resolución y a un costo relativamente bajo.

Alta resolución fluorescente In Situ hibridación en embriones de Drosophila y tejidos utilizando amplificación de la señal de Tyramide

Aquí, presentamos un protocolo para la visualización, detección, análisis y seguimiento del tráfico endógeno de ARNm en cámara de óvulos Drosophila melanogaster en vivo utilizando balizas moleculares, microscopía confocal de disco giratorio y análisis de código abierto Software.

Visualización y seguimiento de ARNm endógenos en cámaras de huevo Drosophila melanogaster en vivo

La hibridación in situ de fluorescencia de ARN de molécula única (smFISH) es un método para cuantificar con precisión los niveles y la localización de ARN específicos a nivel de una sola célula. Aquí, informamos nuestros protocolos de laboratorio validados para el procesamiento de bancos húmedos, imágenes y análisis de imágenes para la cuantificación de células individuales de ARN específicos.

Análisis unicelular de alelos transcripcionalmente activos por FISH de molécula única

Aquí, presentamos un protocolo simplificado de etiquetado de genes endógenos para Drosophila, que utiliza una técnica basada en PCR para la identificación sin marcadores de modificaciones genéticas exitosas, lo que facilita el desarrollo de líneas knock-in estables.

Estrategia basada en CRISPR de un solo paso para el etiquetado de genes endógenos en Drosophila melanogaster

Drosophila es un modelo bien establecido para estudiar moléculas clave que regulan la miogénesis. Sin embargo, los métodos actuales son insuficientes para determinar la dinámica transcripcional del ARNm y la distribución espacial dentro de los sincitios. Para abordar esta limitación, optimizamos un método de hibridación in situ de fluorescencia de ARN que permite la detección y cuantificación de ARNm a escala de una sola molécula.

Estudio de la dinámica transcripcional muscular a escalas de una sola molécula en Drosophila

La hibridación in situ iterativa de fluorescencia asistida por expansión (EASI-FISH) es una técnica robusta que combina la microscopía de expansión con la hibridación in situ de fluorescencia (FISH) para detectar la expresión de múltiples genes en tejido grueso. Este protocolo describe los avances recientes en el método y su adaptación para etiquetar el sistema nervioso central intacto de Drosophila.

Detección múltiple de la expresión génica en el cerebro intacto de Drosophila mediante hibridación in situ de fluorescencia iterativa asistida por expansión

Aprende a detectar transcritos de ARN ribosómico específicos del locus mediante FISH sensible a SNP en Drosophila melanogaster. Este método permite distinguir la transcripción de rDNA del cromosoma X e Y en células germinales.

Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal

Detección de FISH sensible al polimorfismo de un solo nucleótido de la transcripción de ARN ribosómico específico del locus en Drosophila melanogaster

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