Administración de anestésicos volátiles a larvas de pez cebra para observación del comportamiento

Nuestra investigación se centra en la farmacología anestésica, que incluye un interés en los mecanismos anestésicos, así como en los mecanismos de los efectos secundarios de los anestésicos. El uso de larvas de pez cebra como modelo de comportamiento para estudiar la farmacología anestésica se está expandiendo rápidamente y tiene muchas ventajas, incluida su idoneidad para su uso en experimentos de detección a gran escala. La comparación de los anestésicos volátiles e intravenosos sigue siendo un desafío porque la administración de anestésicos volátiles a animales no acuáticos es mucho más fácil que los anestésicos intravenosos.

Por el contrario, los anestésicos intravenosos se administran más fácilmente a los animales acuáticos que los anestésicos volátiles. Este protocolo proporciona un medio relativamente barato y accesible de administrar anestésicos volátiles en una cámara cerrada para realizar experimentos de comportamiento en larvas de pez cebra. Otros protocolos de esta naturaleza a menudo requieren algún tipo de aparato personalizado que puede ser costoso o no fácilmente accesible para aquellos que no tienen los medios para crear o adquirir este tipo de equipo.

Para empezar, extiende una lámina de silicona de 0,5 milímetros sobre una superficie limpia y plana. Inspeccione las sábanas en busca de arrugas y evítelas cuando sea posible. Limpie las sábanas con alcohol al 70% para eliminar el aceite o los residuos.

Cuando la hoja esté completamente seca, use un aplicador, como un pincel, para aplicar una capa delgada y uniforme de imprimación adhesiva a la hoja de silicona. Una vez aplicada la imprimación adhesiva, alinee la cinta de doble capa con la lámina de silicona con el reverso del papel hacia arriba. Aplique gradualmente la cinta sobre la silicona con un rodillo para alisar la superficie y eliminar las burbujas de aire.

Vuelva a aplicar la imprimación en secciones pequeñas según sea necesario y continúe la aplicación de la cinta a medida que la imprimación se seca en uno a cinco segundos. Dale la vuelta a la lámina de silicona para trabajar con el lado de silicona hacia arriba para ayudar a visualizar y eliminar las burbujas de aire. A continuación, corta la silicona adhesiva en tiras de al menos 10 milímetros de ancho.

Asegúrese de que las tiras sean lo suficientemente largas como para cubrir al menos el ancho de una fila de la placa del pocillo. Para preparar los anestésicos volátiles, agregue un volumen del solvente no volátil a un vial de HPLC o centelleo, asegurando un espacio de cabeza mínimo una vez que se agregue la dilución final del anestésico volátil. Use una jeringa hermética a la gasolina Hamilton para agregar el anestésico volátil y selle rápidamente el vial.

Mezcle los viales mediante vórtice o sonicación, según sea necesario. Guárdelos temporalmente mientras prepara platos de pez cebra. Para establecer el experimento de comportamiento, transfiera una larva de pez cebra a los cinco días después de la fertilización a cada dos filas de una placa de vidrio de 96 pocillos.

Retire con cuidado la solución E-tres de cada pocillo. Utilice una pipeta de transferencia para llenar cada pocillo de la fila con la solución experimental. Con las tiras adhesivas de silicona, presione la tira hacia abajo rápidamente para evitar la formación de burbujas y que los peces se desborden hacia los pozos adyacentes.

Luego, presione firmemente la parte superior de la placa para asegurarse de que cada pocillo esté sellado. Repita el proceso de sellado hasta que se cambie la solución y se sellen todos los pocillos de cada fila de la placa. Dé la vuelta suavemente a la placa e inspeccione si hay burbujas de aire.

Coloque la placa en la unidad de observación del comportamiento con el adhesivo de silicona hacia abajo y realice el experimento de comportamiento. En los pozos sellados, la concentración de sevoflurano mostró una pérdida mínima durante tres horas, y el isoflurano mostró una disminución del 4% en la concentración. Ninguno de los anestésicos mostró pérdidas significativas durante los primeros 30 a 60 minutos.

La mediana de la concentración efectiva de sevoflurano fue de 62 micromolares para el movimiento espontáneo y de 126 micromolares para el movimiento provocado, siendo la escalera notablemente más baja que los 240 micromolares informados anteriormente, lo que puede deberse a la mejora en la creación de un sello hermético al gas con este método. Se observó una diferencia significativa en el movimiento espontáneo entre los pozos abiertos y los sellados, emergió a las dos horas, probablemente debido al agotamiento del oxígeno en el pozo, y es una limitación importante de esta técnica.