Obtención de imágenes de superresolución del biofilm de Proteus mirabilis mediante microscopía de expansión

Este artículo presenta un protocolo completo para PmbExM, una técnica de microscopía de expansión diseñada específicamente para biopelículas de Proteus mirabilis . PmbExM utiliza un tratamiento enzimático escalonado de muestras de biopelícula para lograr una expansión isotrópica de 4,3 veces, lo que permite el análisis de superresolución de la organización espacial de las estructuras celulares y subcelulares dentro de estas comunidades microbianas sésiles.

El alcance de nuestra investigación es proporcionar a la comunidad científica un método de superresolución accesible para estudiar la arquitectura, el ensamblaje y las características intercelulares de la biopelícula de proteus mirabilis más allá del límite refractario.

La microscopía cuantitativa de biopelículas es un desafío debido a las limitaciones impuestas por la resolución óptica. La microscopía de expansión de biopelículas de Proteus mirabilis, o PmbExM, contribuirá a mejorar la descripción y el análisis morfológico y topológico de estas complejas comunidades microbianas. Dos ventajas principales de PmbExM es que, en primer lugar, permite la visualización de súper resolución de biopelículas de proteus mirabilis utilizando microscopios convencionales de refracción limitada y, en segundo lugar, no depende de complejas rutinas de procesamiento de datos posteriores a la adquisición.

Nuestro método facilita el estudio a nanoescala de la estructura y organización de la biopelícula a investigadores que carecen de acceso a equipos especializados de súper resolución y con experiencia avanzada en procesamiento o análisis de imágenes digitales.

PmbExM permitirá interrogar la arquitectura, el ensamblaje, las características celulares e intracelulares de la biopelícula proteus mirabilis a nanoescala. Además, su maleabilidad apoya la adaptación y codificación para otras especies de biopelículas.

[Narrador] Para comenzar, agregue 400 microlitros de éster N-hidroxisuccinimílico de ácido metacrílico milimolar, o MA-NHS en PBS a las muestras de biopelícula teñidas e incube a temperatura ambiente durante una hora con agitación suave. Después de una hora, lave suavemente las muestras de biopelícula teñidas tres veces con 300 microlitros de PBS a temperatura ambiente durante 10 minutos cada una. Retire el PBS y agregue 300 microlitros de solución de monómero a las muestras. Incubar durante la noche a cuatro grados centígrados. Para construir las precámaras de gelificación, use un portaobjetos de vidrio como base, luego corte, organice y coloque dos piezas de cinta adhesiva de doble cara doblada en el portaobjetos para que actúen como espaciadores de 400 micrómetros. Organice cámaras húmedas para proteger las muestras de la desecación durante la polimerización. Ahora, prepare un nuevo volumen de solución gelificante mezclando solución de monómero, 10% de tetrametil etilendiamina, 0,5% de 4-hidroxi-TEMPO y 10% de persulfato de amonio en una proporción de 47 a 1 a 1 a 1. Inmediatamente después de preparar la solución gelificante, retire la solución de monómero de las muestras y reemplácela con 300 microlitros de la solución gelificante. Incube las muestras a cuatro grados centígrados durante cinco minutos. Mientras tanto, retire la cubierta protectora restante de las tiras de cinta adhesiva de doble cara dispuestas en los portaobjetos de vidrio. Pipetear 40 microlitros de solución gelificante entre los espaciadores. Una vez completada la incubación de la muestra, use pinzas para levantar cada cubreobjetos que contenga biofilm y colóquelo encima de la gota de 40 microlitros de solución gelificante en el portaobjetos. Oriente el cubreobjetos de modo que el biofilm, en su superficie, entre en contacto con la solución gelificante. Termine de construir la cámara de gelificación presionando suavemente el cubreobjetos que contiene biofilm con unas pinzas para asegurar la adhesión a los espaciadores de cinta. Coloque la cámara de gelificación ensamblada dentro de una cámara húmeda para permitir la polimerización e incube a 37 grados centígrados sin agitar durante dos horas. Después de dos horas, desmonte las cámaras de gelificación y use una cuchilla quirúrgica para recortar el exceso de gel alrededor de la región de interés de la muestra de biopelícula. Coloque los cubreobjetos que transportan los geles recortados en una nueva placa de 24 pocillos con el lado del gel hacia arriba. Después de la digestión enzimática de las muestras gelificadas con solución de proteinasa K, retire la solución de proteinasa y transfiera cada gel a una placa de Petri separada de 60 milímetros para la expansión de las muestras. Llene cada placa de Petri con exceso de agua desionizada para que el gel esté completamente sumergido e incube bajo agitación suave a temperatura ambiente durante 20 minutos. Después de completar el quinto intercambio de agua, retire el agua desionizada que cubre el gel. Use un cepillo plano pequeño para empujar suavemente la muestra sobre un cubreobjetos de vidrio de 24 por 50 milímetros. Retire el exceso de agua del gel con papel de seda. Coloque con cuidado el gel sobre la superficie de vidrio de la cámara de imágenes, asegurándose de que no queden burbujas de aire atrapadas entre el gel y el vidrio. Finalmente, agregue agua desionizada a la cámara de imágenes hasta que el gel esté completamente sumergido. Se utilizaron análisis cuantitativos y espaciales para evaluar la fidelidad de expansión y la preservación morfológica de las biopelículas de proteus mirabilis después de la microscopía de expansión de la biopelícula de proteus mirabilis o el tratamiento con PmbExM. La técnica PmbExM amplió las estructuras de la biopelícula en aproximadamente 4,3 veces manteniendo tanto la morfología celular como la organización topológica. Esta expansión aumentó significativamente la resolución visual de las células bacterianas, haciendo que las estructuras celulares individuales sean más nítidas y definidas. Con la resolución mejorada, PmbExM también permitió la identificación clara de disposiciones bacterianas de múltiples capas dentro de la biopelícula que antes no se resolvían. PmbExM también facilitó la visualización de estructuras subcelulares previamente irresolubles, incluidos distintos patrones de organización del ADN. Estos patrones organizativos fueron confirmados por perfiles de intensidad de línea, que revelaron múltiples picos de fluorescencia distintos en muestras expandidas en comparación con el pico único observado en células no expandidas.