Agotamiento rápido de macrófagos renales utilizando la herramienta de ablación celular humana CD59/Intermedilysin

Utilizamos la oblación mediada por intermedilisina de la célula que expresa CD59 humana en ratones para estudiar la regeneración de microfagos renales, centrándonos en la recuperación de monocitos impulsada por quimiocinas y el establecimiento de nichos de vigilancia inmune después de la lesión. Los desarrollos recientes en nuestro campo revelan el mecanismo de regeneración de macrófagos renales, destacando una quimiocina específica que recluta macrófagos y cómo se restablece la vigilancia inmune después de una lesión renal aguda. Combinamos criogenética inducible por tamoxifeno, ablación con intermedilisina, citometría de flujo multiparamétrica y microscopía intravital para extirpar, rastrear y visualizar macrófagos renales en tiempo real.

Los desafíos clave son evitar la inflamación sistémica, apuntar solo a los macrófagos residentes y medir la regeneración rápida sin alterar el delicado mIcroambiente renal. Demostramos que los monocitos restauran el 88% de los macrófagos renales dentro de los siete días posteriores a la ablación, un proceso que depende críticamente del eje de señalización CX3 CR1, CX3 CL1. Para comenzar, precaliente el aceite de maíz a 42 grados centígrados.

Disuelva 100 miligramos de tamoxifeno en cinco mililitros de aceite de maíz precalentado para preparar una solución madre con una concentración de 20 miligramos por mililitro. Administrar tamoxifeno por vía intraperitoneal a ratones machos de 10 a 12 semanas de edad a una dosis de 100 microgramos por gramo de peso corporal. Después de 15 días, inyecte una dosis intravenosa única de intermedilisina en los ratones a una dosis de 120 nanogramos por gramo de peso corporal.

Monitorear y confirmar la ablación de macrófagos residentes y la regeneración posterior mediante la realización de citometría de flujo al uno, tres y siete días, después de la administración de intermedilisina. Para la recolección de riñones, use fórceps finos y tijeras para hacer una incisión horizontal en la región abdominal inferior de un ratón sacrificado. Extienda la incisión verticalmente a lo largo de la línea media hasta justo debajo de la caja torácica o el esternón.

Retraiga suavemente la piel y el músculo para descubrir la cavidad torácica. Corta la aurícula derecha para permitir que la sangre drene de la circulación. Inserte una aguja de calibre 21 a 23 en el ventrículo izquierdo.

Comience la perfusión con 10 a 20 mililitros de PBS frío para eliminar la sangre. Continúe la perfusión hasta que los riñones parezcan pálidos, lo que indica una eliminación sanguínea efectiva. Ubique los riñones contra la pared dorsal del cuerpo y sepárelos suavemente de los tejidos circundantes con fórceps y tijeras.

Extirpe las cápsulas renales y coloque inmediatamente los riñones en PBS frío para evitar la degradación. Prepare 100 mililitros de cóctel de enzimas de digestión mezclando HBSS sin calcio y magnesio, colagenasa IV y ADNasa I. Prepare la solución enzimática fresca y manténgala en hielo hasta su uso. Con unas tijeras estériles, pique los riñones en pequeños fragmentos en una placa de Petri que contenga cinco mililitros de HBSS.

Transfiera el tejido renal picado a tubos de 15 mililitros que contengan 10 mililitros de la solución enzimática preparada. Ahora incube los tubos a 37 grados centígrados durante 30 minutos con una agitación suave para disociar el tejido. Triture suavemente el tejido con una pipeta o un émbolo de jeringa para romper aún más los grumos celulares.

Elimine los desechos pasando la suspensión celular a través de un filtro celular de 40 micrómetros. Centrifugar la suspensión celular a 700 G durante 10 minutos a 18 grados centígrados. A continuación, decanta cuidadosamente el tampón.

Vuelva a suspender el gránulo en cinco mililitros de tampón de lisis antes de incubar a temperatura ambiente durante cinco minutos para lisar los glóbulos rojos. Agregue PBS para lavar las células y eliminar el tampón de lisis. Mantenga la suspensión unicelular resultante en hielo hasta su uso posterior.

Para la centrifugación en gradiente de densidad, primero vuelva a suspender el sedimento celular en 10 mililitros de solución de gradiente de densidad al 30%. Coloque cuidadosamente esto en capas sobre tres mililitros de solución de gradiente de densidad al 70% en un tubo de centrífuga. Centrifugar el gradiente a 500 G durante 30 minutos sin aplicar descanso.

Después de la centrifugación, recoja cuidadosamente la capa de interfaz entre las soluciones del 30% y el 70%. Lave las células recolectadas dos veces con 10 mililitros de PBS y centrifugue cada lavado a 500 G durante 10 minutos. Vuelva a suspender el sedimento de celda final en un mililitro de tampón FACS en un tubo de 1,5 mililitros.

Cuente las células con un hemocitómetro bajo un microscopio de campo claro y ajuste la concentración celular a dos veces 10 a la potencia de seis células por mililitro. Granular las células en tubos de 1,5 mililitros centrifugando a 650 G durante cinco minutos y volver a suspender el sedimento celular en un mililitro de tampón FACS. Agregue anticuerpo anti CD 16 o 32 en una dilución de uno a 200 para bloquear la unión inespecífica del receptor de FC.

Después de incubar las células durante 15 minutos a cuatro grados Celsius, tiña las células con colorante aguamarina vivo/muerto y un cóctel de anticuerpos preconjugados, incluidos CD45 E 450, CD11 B PE SI7, HCD59 PE y F4/80 BV 605. Agregue el cóctel de anticuerpos directamente a la suspensión celular. Incube la muestra durante 30 minutos a cuatro grados centígrados en la oscuridad para proteger los fluoróforos.

Luego lave las celdas dos veces con tampón FACS. Fije las células en paraformaldehído al 1% durante 30 minutos en hielo. Luego lave las celdas dos veces con tampón FACS para eliminar el fijador residual.

Adquiera células teñidas y fijadas con un citómetro de flujo. Analice los datos utilizando el software. Identificar los macrófagos y microglías residentes en el riñón y otros tejidos utilizando los marcadores CD45, CD11B y F4/80.

Realice la compuerta inicial para seleccionar celdas vivas utilizando perfiles de dispersión directa y lateral. Elimine los dobletes utilizando el área de dispersión hacia adelante frente a la compuerta de altura. Excluir las células muertas utilizando el colorante de viabilidad.

Enriquecer las células inmunitarias mediante la activación de poblaciones positivas para CD45. Defina los macrófagos residentes en el riñón como células CD11b + F4 / 80hi dentro de la puerta positiva CD45 como se muestra en la estrategia de compuerta. Defina las poblaciones de microglía como células intermedias CD11b + CD45 y realice el análisis final.

Se observó una sola banda de proteína prominente cerca de 54 kilodalton en el gel de la página SDS, lo que confirma la pureza y el peso molecular esperado de la intermedilisina recombinante. La intermedilisina purificada exhibió una fuerte actividad hemolítica de una manera dependiente de la dosis, logrando una lisis de glóbulos rojos del 50% a 7,24 nanogramos por mililitro y una lisis casi completa a 650 nanogramos por mililitro. El análisis de citometría de flujo confirmó el agotamiento exitoso y selectivo de los macrófagos renales en ratones cre-R del compuesto CD59 humano inducible un día después de la administración de intermedilisina, sin agotamiento en ratones de control.

Los macrófagos renales comenzaron a repoblarse al tercer día y se recuperaron a aproximadamente el 88% de su población original al séptimo día. Solo el 5% de los macrófagos renales recién regenerados expresaron CD59 humano al séptimo día, lo que indica que la repoblación se produjo principalmente a través del reclutamiento de monocitos en lugar de la proliferación in situ.