Ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster

Nuestra investigación utiliza herramientas optogenéticas para estudiar cómo los circuitos neuronales de Drosophila melanogaster gobiernan comportamientos, como la termotaxis y la gestación. Al controlar neuronas específicas con luz, nuestro objetivo es comprender cómo estos circuitos impulsan las respuestas sensoriales e influyen en la toma de decisiones con alta precisión. La optogenética es una tecnología valiosa en neurociencia, que ofrece un control preciso de la actividad neuronal mediante la luz.

En Drosophila melanogaster, herramientas como CsChrimson y GtACR2 permiten la activación e inhibición dirigidas de las neuronas. Estas herramientas permiten a los investigadores manipular circuitos neuronales, estudiar el comportamiento y explorar las respuestas de los sensores con alta especificidad. Nuestro protocolo ofrece un enfoque sencillo, rentable y reproducible para la manipulación optogenética en Drosophila.

Utiliza materiales disponibles comercialmente, lo que lo hace accesible en laboratorios y aulas con recursos limitados. Los métodos también son altamente adaptables, lo que permite el estudio de comportamientos atractivos y evitativos con desafíos técnicos mínimos. Para empezar, obtenga moscas Drosophila macho y hembra, que expresan GtACR2 en celdas de calentamiento.

Alinee dos placas de acero en placas calefactoras separadas para que sus bordes se unan. Coloque un protector de lámina de plástico encima y asegúrelo con cinta adhesiva para minimizar el movimiento. Ahora, coloque una hoja de papel blanco en el protector de hojas para reducir las señales de ruido de fondo y coloque una cubierta de plástico transparente encima del papel blanco.

A continuación, corta un agujero en la parte inferior de una caja de espuma de poliestireno para acomodar la cámara y la luz azul a unos 12 centímetros por encima de la superficie experimental. Coloque la cámara y la luz azul para minimizar el deslumbramiento, al tiempo que garantiza la activación. Configure la cámara para grabar con un lapso de tiempo de un segundo, campo estrecho y una resolución de 4.000 x 3.000 píxeles.

Ajuste la configuración de la placa calefactora para mantener una temperatura superficial de 25 más o menos un grado Celsius y 31 más o menos un grado Celsius en las placas de acero respectivas. Controle las temperaturas de las placas de acero utilizando una sonda de temperatura superficial antes y después de cada prueba. A continuación, coloque la cubierta de plástico sobre la placa de acero a 25 grados centígrados.

Ahora, usando un aspirador de moscas, suelte suavemente una sola mosca debajo de la cubierta. Coloque la caja por encima del área experimental para crear una luz tenue por debajo de 10 lux y deje que la mosca se aclimate durante un minuto. Después del período de aclimatación, levante la caja y ajuste rápidamente la cubierta de plástico para que el centro de la cubierta se alinee con el límite de la placa de acero.

Inicie la prueba, encienda la cámara y la luz azul a 20 kilolux. Captura la actividad de las moscas durante dos minutos. Después de dos minutos, apague la cámara y la luz.

Deseche las moscas con el aspirador. Anestesia moscas macho y hembra hambrientas que expresan CsChrimson en neuronas receptoras de sabor dulce en hielo. Aplica de siete a 10 puntos pequeños de pegamento en un portaobjetos de vidrio.

Coloque una mosca con el lado ventral hacia arriba en cada punto de pegamento, asegurándose de que el tórax y las alas entren en contacto con el pegamento para minimizar el movimiento. Ventile las alas hacia cada lado para aumentar el área de superficie adhesiva. Coloque las toallas de papel mojadas en una caja de humedad y transfiera los portaobjetos a la caja.

Después de dos horas de recuperación, coloque el portaobjetos bajo el microscopio. Use una jeringa para administrar una gota de agua para saciar las moscas, evitando las extensiones de la probóscide inducidas por la sed. Sostenga manualmente un puntero láser rojo y haga brillar la luz roja en la probóscide o la cabeza de una sola mosca a 700 lux.

Observe la respuesta de extensión de la probóscide a través del microscopio dentro de una ventana de 30 segundos. Después de probar la extensión de la probóscide inducida por la luz, examine la respuesta a la sacarosa al 4%. Expulsa una gota de sacarosa en el extremo de la aguja de la jeringa y acércala a la probóscide de la mosca.

Primero, ensambla el laberinto de moscas para el experimento. En condiciones de oscuridad o poca luz, coloque 10 moscas macho y 10 hembras que expresan CsChrimson en el tubo de carga y conéctelo a la cámara de retención. Incline el elevador y golpee suavemente el tubo para mover las moscas a la cámara de retención.

Después de transferir las moscas a la cámara de retención, use el elevador para bajarlas entre el tubo de carga y los orificios del tubo de ensayo. A continuación, retire el tubo de carga. Coloque el laberinto de moscas aproximadamente a 13 centímetros de distancia de la fuente de luz roja de 1.000 miliamperios sin encender la luz.

Baje el elevador hasta que la cámara de retención se alinee con los orificios del tubo de ensayo, permitiendo que las moscas se muevan libremente entre los tubos de ensayo envueltos en papel de aluminio y descubiertos. Al mismo tiempo, encienda la luz roja a aproximadamente 40 kilolux para activar CsChrimson. Deje que las moscas elijan entre el tubo expuesto a la luz roja y el tubo sombreado durante un minuto.

Después de un minuto, levante el elevador entre el tubo de carga y los orificios del tubo de prueba. Retira las moscas de cada tubo. Cuéntalos y registra los números.

Limpie el elevador de moscas y el laberinto de moscas con agua destilada después de cada prueba. En el ensayo de preferencia posicional, optogenética, termotáctica y de luz azul, las moscas evitaron el lado de 31 grados Celsius en las condiciones de control, mientras que en luz azul con suplementación con ATR, las moscas no mostraron preferencia entre 25 y 31 grados Celsius, lo que indica inhibición de la neurona HC a través de la activación de GtACR2. En condiciones de control, las moscas mostraron una respuesta mínima de extensión de la probóscide, mientras que la activación de la luz roja con la suplementación con ATR resultó en una extensión significativa de la probóscide, lo que demuestra la activación de las neuronas sensibles al dulce por CsChrimson.

En el ensayo de luz roja, optogenético y laberinto de moscas, los grupos de control no mostraron ninguna preferencia, mientras que la activación de la luz roja con la suplementación con ATR hizo que las moscas evitaran el tubo descubierto, lo que indica una activación de neuronas de detección amarga por CsChrimson.