Name: Ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-07T14:50:00.000+00:00
Duration: 7 min 39 s
Description: Aprende ensayos conductuales para manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster. Este método permite estudiar termotaxis y respuestas gustativas con precisión usando CsChrimson y GtACR2.

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1. Cepas, cría de moscas y aspirador de moscas
<ol>
	<li>Deformaciones y mantenimiento<ol>
		<li>Las cepas utilizadas en los experimentos incluyen HC-Gal410, Gr5a-Gal420 (Bloomington Drosophila Stock Center (BDSC): 57592), Gr66a-Gal421 (BDSC: 57670), UAS-GtACR23, UAS-CsChrimson2 (BDSC: 55136). La parte trasera vuela a 25 °C en un medio de harina de maíz estándar bajo un ciclo de luz de 12 h: 12 h de oscuridad. NOTA: 1 L de medio de harina de maíz contiene 1 L dH2O, 79 g de dextrosa, 7,5 g de agar, 24 g de levadura en escamas, 57 g de harina de maíz, 2,1 g de metil-4-hidroxibenzoato (disuelto en 11,1 mL de etanol), 6 g de tartrato de sodio y potasio tetrahidratado y 0,9 g de cloruro de calcio.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Cría de moscas y preparación experimental<ol>
		<li>Clasifique las moscas de 0 a 3 días de edad. En el momento de la experimentación, las moscas tendrán de 3 a 6 días de edad, lo que garantiza la consistencia relacionada con la edad (Figura 1A).</li>
		<li>Divida cada genotipo en cuatro grupos 3 días antes de realizar los experimentos: ATR de luz ambiental, ATR + de luz ambiental, ATR de luz roja o azul y ATR+ de luz roja o azul.</li>
		<li>Prepare una solución madre de ATR de 80 mM disolviendo ATR en etanol al 100%. Complementar el alimento con 400 μM de ATR a los grupos ATR+.</li>
		<li>Complementar el alimento con la misma concentración de etanol pero sin ATR a los grupos ATR.</li>
		<li>Rear a todos los grupos en la oscuridad22.</li>
		<li>Starve Gr5a&gt;CsChrimson vuela durante 16-24 horas en viales que contienen solo tejido húmedo. Los viales ATR+ contienen 400 μM de ATR mezclado con agua, mientras que los viales ATR contienendH2O mezclado con la misma concentración de etanol.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Aspirador de moscas<ol>
		<li>Ensamble el aspirador de moscas (Figura 1B) usando un tubo de plástico, una mosquitera y dos pipetas de transferencia de 3 mL.</li>
		<li>Corte las puntas y los bulbos de las pipetas de transferencia, asegurándose de que la punta de succión de moscas permita el paso cómodo de una mosca. Este diseño permite una aspiración suave de moscas a través de la inhalación, minimizando el daño y facilitando la recolección y transferencia eficiente de moscas individuales.</li>
		<li>Coloque una mosquitera sobre el tubo de plástico y asegure los extremos de la pera de la pipeta al tubo con Parafilm.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
2. Ensayo de preferencia posicional termotáctica optogenética de luz azul de una sola mosca
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila y cría de moscas<ol>
		<li>Cruce la línea de controladores HC-Gal410 con UAS-GtACR23, lo que da como resultado el genotipo experimental HC&gt;GtACR2. Las moscas HC&gt;GtACR2 expresan GtACR2 en las celdas de calentamiento. NOTA: Asegúrese de utilizar el mismo número de moscas macho y hembra para cada condición.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuración y ejecución de ensayos experimentales<ol>
		<li>Alinee dos placas de acero en placas calefactoras separadas para que sus bordes se unan. Coloque un protector de lámina de plástico encima, asegurándolo con cinta adhesiva para minimizar el movimiento. Coloque un pedazo de papel blanco sobre el protector de hojas para reducir las señales de ruido de fondo (Figura 1C). NOTA: Reemplace el papel blanco al comienzo de cada experimento o cuando esté sucio.</li>
		<li>Coloque una cubierta de plástico transparente (2 mm de alto × 58 mm de ancho × 83 mm de largo) encima del papel blanco. Esta cubierta permite que la mosca camine libremente a la vez que evita que vuele.</li>
		<li>Corta un agujero en la parte inferior de una caja de espuma de poliestireno (27 cm de altura × 22 cm de ancho × 16 cm de largo) para que se adhiera a la cámara y a la luz azul (1.000 mA) a unos 12 cm por encima de la superficie experimental.</li>
		<li>Coloque la cámara y la luz azul para minimizar el deslumbramiento mientras habilita la activación. NOTA: Es posible que se requiera una prueba previa para determinar el rango de activación de la luz azul.</li>
		<li>Configure la cámara para grabar con los siguientes ajustes: lapso de tiempo de 1 s, campo estrecho, 4000 × 3000 píxeles.</li>
		<li>Ajuste la configuración de la placa calefactora para mantener una temperatura superficial de 25 ± 1 °C y de 31 ± 1 °C en las placas de acero respectivas. NOTA: Para condiciones que requieren temperaturas inferiores a 25 °C, son necesarios métodos de enfriamiento alternativos, como dispositivos Peltier o hielo. Si las temperaturas de las placas de acero superan los niveles deseados, rocíe la superficie con agua destilada para lograr y mantener las condiciones requeridas. Luego, use una servilleta para absorber el exceso de humedad del protector de láminas de plástico.</li>
		<li>Antes y después de cada prueba, controle las temperaturas con una sonda de temperatura de superficie. NOTA: El control preciso de la temperatura es crucial, ya que las fluctuaciones pueden afectar los resultados.</li>
		<li>Coloque la cubierta de plástico en el lado de 25 °C. Con un aspirador de moscas, suelte suavemente una sola mosca debajo de la cubierta. Coloque la caja sobre el área experimental para crear una luz tenue (&lt;10 lux) y permita que la mosca se aclimate durante 1 minuto.</li>
		<li>Después del período de aclimatación, levante la caja y ajuste rápidamente la cubierta de plástico, colocándola con el centro de la cubierta alineado con el límite de la placa de acero para garantizar una cobertura uniforme de los lados de 25 °C y 31 °C. NOTA: Durante este proceso, la temperatura del aire y la temperatura dentro de la cubierta en el lado de 31 °C aumentan a aproximadamente 27 °C en 5 s (Figura complementaria 1), suficiente para activar las celdas de calentamiento11.</li>
		<li>Inicie la prueba encendiendo la cámara y la luz azul (20 kLux). NOTA: No encienda la luz azul en condiciones de luz ambiental. Encienda la cámara y grabe algunos fotogramas antes de encender la luz azul en caso de movimiento.</li>
		<li>Después de más de 2 minutos, finalice la prueba apagando la cámara y la luz. Deseche las moscas con el aspirador. NOTA: Grabe algunos fotogramas adicionales en caso de movimiento al apagar la cámara.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis conductual y estadístico<ol>
		<li>Analice solo los datos de las moscas que permanecen en el lado de 25 °C al comienzo del ensayo. NOTA: Deseche los datos de las moscas que inician ensayos en el lado de 31 °C, que a menudo presentan preferencias alteradas23. Descarte los ensayos con moscas que no se acerquen al borde del lado de 31 °C, asegurándose de que hayan elegido entre las temperaturas. Deseche los datos de las moscas que permanezcan inmóviles durante más de 30 s.</li>
		<li>Analice los resultados utilizando los procedimientos descritos anteriormente23. Calcule el índice de preferencia (IP) como la relación entre la diferencia de tiempo que la mosca pasó en cada zona de temperatura y el tiempo total, como se muestra en la siguiente fórmula: 
		<img alt="Equation 1" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq01.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Los detalles estadísticos de los experimentos se proporcionan en las leyendas de las figuras. El análisis de datos se realiza utilizando un software de análisis de datos adecuado.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
3. Ensayo de preferencia posicional optogenética de luz roja de una sola mosca
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila y cría de moscas<ol>
		<li>Cruce la línea de controladores Gr66a-Gal421 a UAS-CsChrimson2, lo que da como resultado el genotipo experimental Gr66a&gt;CsChrimson. Las moscas Gr66a&gt;CsChrimson expresan CsChrimson en las neuronas de sabor amargo. NOTA: Asegúrese de utilizar el mismo número de moscas macho y hembra para cada condición.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuración y ejecución de ensayos experimentales<ol>
		<li>Realice el ensayo en una habitación oscura o en un entorno oscuro para garantizar una activación controlada de CsChrimson (Figura 1D).</li>
		<li>Coloque una videocámara a unos 45 cm por encima de la superficie experimental.<ol>
			<li>Utilice una videocámara sin filtro de infrarrojos. Si una videocámara tiene un filtro infrarrojo interno de paso corto que bloquea longitudes de onda superiores a 700 nm, retírelo.</li>
			<li>Adhiera un filtro de paso largo de 830 nm sobre la lente con superpegamento para capturar las longitudes de onda infrarrojas. Este ajuste es esencial para registrar el movimiento de la mosca en condiciones de luz infrarroja.</li>
		</ol>
		</li>
		<li>Coloque una fuente de luz roja24 aproximadamente a 45 cm por encima de la superficie experimental, asegurando una intensidad de luz de aproximadamente 2,5 kLux (1.000 mA). NOTA: Se recomienda una protección ocular adecuada que pueda filtrar el láser/luz roja. Las gafas de seguridad láser ayudan a prevenir posibles daños oculares por la exposición directa a la luz roja intensa.</li>
		<li>Use una luz infrarroja para visualizar las moscas dentro de la instalación. Mantenlo encendido durante todo el experimento. NOTA: Evite el deslumbramiento en el área experimental causado por la luz infrarroja; El deslumbramiento puede complicar el análisis de datos.</li>
		<li>Use pegamento para colocar un filtro infrarrojo de paso largo de 780 nm en la mitad de la cubierta de plástico. NOTA: Utilice cualquier filtro de paso largo que bloquee longitudes de onda inferiores a 780 nm. El lado sin filtrar permite el paso de la luz roja y los infrarrojos, mientras que el lado filtrado solo permite el paso de la luz infrarroja.</li>
		<li>Coloque un material negro mate debajo del área experimental para minimizar el ruido de fondo.</li>
		<li>Coloque una sola mosca debajo de una cubierta de plástico transparente (2 mm de alto × 58 mm de ancho × 83 mm de largo) con un aspirador de moscas y deje que se aclimate durante 1 minuto.</li>
		<li>Espere hasta que la mosca sea visible en el lado sin filtrar. Inicie la prueba encendiendo la videocámara y la luz roja. NOTA: La videocámara es susceptible al movimiento inmediatamente después de iniciarse. Asegure bien la cámara mientras graba y enciéndala varios segundos antes de grabar para evitar movimientos aberrantes que puedan complicar el análisis. No encienda la luz roja hasta el inicio de la prueba.</li>
		<li>Registra el movimiento de la mosca durante 1 min. NOTA: Descarte los ensayos en los que la mosca no se acerque a la línea media o no se mueva durante más de 15 s.</li>
		<li>Después de 1 minuto, finalice la prueba apagando la videocámara y la luz. Deseche las moscas con el aspirador. NOTA: Grabe algunos fotogramas adicionales para evitar los efectos del movimiento al apagar la cámara.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis conductual y estadístico<ol>
		<li>Analice los resultados utilizando los procedimientos descritos anteriormente23. Calcule el índice de preferencia (IP) como la relación entre la diferencia entre el tiempo que la mosca pasó en el área sin el filtro y el área con el filtro y el tiempo total, como se muestra en la siguiente fórmula: 
		<img alt="Equation 2" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq02.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Los detalles estadísticos de los experimentos se proporcionan en las leyendas de las figuras. El análisis de datos se realiza utilizando un software de análisis de datos adecuado.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
4. Respuesta de extensión de la probóscide optogenética de luz roja
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila y cría de moscas<ol>
		<li>Cruce la línea de controladores Gr5a-Gal420 a UAS-CsChrimson2, lo que da como resultado el genotipo experimental denominado Gr5a&gt;CsChrimson. Las moscas Gr5a&gt;CsChrimson expresan CsChrimson en las neuronas receptoras del sabor dulce. NOTA: Asegúrese de utilizar el mismo número de moscas macho y hembra para cada condición.</li>
		<li>Las moscas hambrientas durante 16-24 h con ATR (ATR +) o sin (ATR -) antes de la prueba. NOTA: Es posible que se requieran períodos de inanición más largos para provocar una respuesta fuerte.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuración y ejecución de ensayos experimentales<ol>
		<li>Anestesiar las moscas enfriándolas en hielo (Figura 1E). NOTA: Evite el contacto directo entre las moscas y el hielo. Limite el tiempo de enfriamiento a aproximadamente 1 minuto; El enfriamiento prolongado puede provocar problemas de recuperación y mortalidad.</li>
		<li>Utilice la punta de una pipeta de 1000 μL para aplicar de 7 a 10 puntos pequeños de pegamento en los portaobjetos de vidrio. NOTA: Pequeñas gotas de pegamento en el portaobjetos aseguran que la mosca no se sumerja y ayudan a evitar que el pegamento se pegue a su probóscide o patas.</li>
		<li>Coloque una mosca, con el lado ventral hacia arriba, en cada punto de pegamento. Asegúrese de que el tórax y las alas entren en contacto con el pegamento para minimizar el movimiento. Ventile las alas hacia cada lado para aumentar el área de superficie adhesiva. NOTA: Evite colocar moscas demasiado juntas, lo que puede activar inadvertidamente varias moscas durante la exposición a la luz.</li>
		<li>Deja que el pegamento se seque durante unos 10 minutos.</li>
		<li>Transfiera los portaobjetos a una caja de humedad (una caja de plástico con toallas de papel húmedas) y deje que las moscas se recuperen durante 2 h.</li>
		<li>Coloque el portaobjetos bajo el microscopio. Use una jeringa para administrar una gota de agua para saciar las moscas, evitando las extensiones de la probóscide inducidas por la sed.</li>
		<li>Sostenga manualmente un puntero láser rojo para iluminar con luz roja la probóscide/cabeza de una sola mosca (700 lux) mientras observa la respuesta PER a través del microscopio. NOTA: La protección ocular que pueda filtrar el láser/luz roja es esencial cuando se observa la luz roja a través del microscopio.</li>
		<li>Observe y registre la extensión de la probóscide dentro de una ventana de 30 s. Anote cada mosca utilizando el siguiente sistema de registro: 0 indica que no hay extensión, 0.5 indica que hay 1-2 s de extensión, 1 indica que la extensión dura más de 3 s.</li>
		<li>Después de probar la extensión de la probóscide inducida por la luz, examine la respuesta a la sacarosa al 4% con una jeringa. Expulsa una gota de sacarosa en el extremo de la aguja y acércala a la probóscide de la mosca. NOTA: Deseche los datos de las moscas que no respondan a la gota de sacarosa.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis conductual y estadístico<ol>
		<li>Realizar análisis estadísticos utilizando un software de análisis de datos adecuado. NOTA: Los detalles estadísticos de los experimentos se proporcionan en las leyendas de las figuras.</li>
	</ol>
	</li>
</ol>
5. Ensayo de laberinto de moscas optogenéticas de luz roja
<ol>
	<li>Cepas de Drosophila y cría de moscas<ol>
		<li>Cruce la línea de controladores Gr66a-Gal421 a UAS-CsChrimson2, lo que da como resultado el genotipo experimental Gr66a&gt;CsChrimson. Las moscas Gr66a&gt;CsChrimson expresan CsChrimson en las neuronas de sabor amargo. NOTA: Asegúrese de que cada grupo contenga el mismo número de moscas macho y hembra.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Montaje de laberinto de moscas<ol>
		<li>Haga el laberinto de moscas como se muestra en la Figura 1F. NOTA: Alternativamente, imprima en 3D los componentes del laberinto de moscas, ensamblándolos como se detalló anteriormente25.</li>
		<li>Corta tres tubos de cultivo de plástico de 5 ml a la longitud adecuada para hacer un tubo de carga, un tubo de ensayo transparente descubierto y un tubo de ensayo cubierto con papel de aluminio. Conecte los tubos al laberinto de moscas como se muestra en la Figura 1F.<ol>
			<li>Dependiendo del material del laberinto, corte los tubos de ensayo para garantizar la misma distancia para cada condición de prueba. Según la longitud de la cámara de retención, acorte el tubo de ensayo descubierto en un laberinto transparente, mientras acorta el tubo de ensayo cubierto con papel de aluminio si el laberinto es opaco.</li>
		</ol>
		</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Configuración y ejecución de ensayos experimentales<ol>
		<li>En condiciones de oscuridad o poca luz, coloque 10 machos y 10 hembras en el tubo de carga. Conecte el tubo de carga a la cámara de retención. Incline el elevador y golpee suavemente el tubo para mover las moscas a la cámara de retención. NOTA: Baje el elevador de modo que solo quede abierta la mitad de la cámara de retención. Esta manipulación facilita la transferencia de moscas desde el tubo de carga a la cámara de retención.</li>
		<li>Después de que las moscas se transfieran a la cámara de retención, use el elevador para bajar las moscas entre el tubo de carga y los orificios del tubo de prueba. A continuación, retire el tubo de carga.</li>
		<li>Coloque el laberinto de moscas a una distancia aproximada de 13 cm de la fuente de luz roja (1000 mA) sin encender la luz.</li>
		<li>Baje el elevador hasta que la cámara de retención se alinee con los orificios del tubo de ensayo, permitiendo que las moscas se muevan libremente entre los tubos de ensayo envueltos en papel de aluminio y los descubiertos. Al mismo tiempo, encienda la luz roja para activar CsChrimson. Asegúrese de que la intensidad de la luz roja en la superficie del tubo de ensayo descubierto sea de aproximadamente 40 kLux. NOTA: No encienda la luz roja hasta que la cámara de retención esté bajada y alineada con los orificios del tubo de ensayo. Se recomienda una protección ocular adecuada que pueda filtrar el láser/luz roja debido al intenso brillo de la luz roja.</li>
		<li>Las moscas eligen entre el tubo expuesto a la luz roja y el tubo sombreado durante un minuto.</li>
		<li>Después de 1 minuto, levante el elevador entre el tubo de carga y los orificios del tubo de prueba. Cuenta las moscas en cada tubo. NOTA: Solo se cuentan las moscas activas y no heridas.</li>
		<li>Limpie el elevador de moscas y el laberinto de moscas con dH2O después de cada prueba.</li>
	</ol>
	</li>
	<li>Análisis de datos y estadísticas<ol>
		<li>Calcule el índice de preferencia (IP) como la relación entre la diferencia en el número de moscas entre los tubos descubiertos y cubiertos y el número total de moscas, como se muestra en la siguiente fórmula: 
		<img alt="Equation 3" src="/files/ftp_upload/67964/67964eq03.jpg" style="margin: auto;"> NOTA: Los detalles estadísticos de los experimentos se proporcionan en las leyendas de las figuras. El análisis de datos se realiza utilizando un software de análisis de datos adecuado</li>
	</ol>
	</li>
</ol>

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<li>Chyb, S., Dahanukar, A., Wickens, A., Carlson, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Drosophila+gr5a+encodes+a+taste+receptor+tuned+to+trehalose%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Drosophila gr5a encodes a taste receptor tuned to trehalose.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (Suppl 2), 14526-14530 (2003).</li>
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<li>Titlow, J. S., Johnson, B. R., Pulver, S. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Light+activated+escape+circuits%3A+A+behavior+and+neurophysiology+lab+module+using+drosophila+optogenetics%5BTitle%5D)+AND+%22J+Undergrad+Neurosci+Educ%22%5BJournal%5D)">Light activated escape circuits: A behavior and neurophysiology lab module using drosophila optogenetics.</a> J Undergrad Neurosci Educ. 13 (3), A166-A173 (2015).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Controlador LED de 1000 mA</td><td>Luxeon Star</td><td>3021-D-E-1000</td><td></td></tr><tr><td>5 mL Tubos de cultivo VWR, plástico, con tapones de doble posición</td><td>VWR</td><td>60818-664</td><td></td></tr><tr><td>780 Filtro de paso largo / IR 780 nm 100 mm x 100 mm</td><td>Filtros Lee</td><td>BH #LE8744</td><td>Cortado a aproximadamente 47 x 100 se ajusta a la cubierta de plástico</td></tr><tr><td>Agfabric 6.5 pies x 15 pies Red de insectos Red de jardín para proteger plantas Verduras Flores Frutas</td><td>The Home Depot</td><td>EIBNW6515</td><td></td></tr><tr>Placa <td>de aluminio Sigma-Aldrich</td><td>116-31-4</td><td></td>totalmente<td>retiniana</td></tr><tr><td>(30,5 cm x 30,5 cm x 0,6 cm)</td><td>Amazon</td><td></td><td>comprado en Amazon</td></tr><tr><td>Caja de plástico negra</td><td>LI-COR</td><td>929-97101</td><td></td></tr><tr><td>CLORURO DE CALCIO ANHYDRO 25GR</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AC297150250</tr><tr><td>CX405 Handycam con sensor CMOS Exmor R</td><td>SONY</td><td>HDR-CX405</td><td></td></tr><tr><td>Elmer' s &ldquo; pegamento escolar"</td><td>Elmer</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alcohol etílico, puro (200 grados)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E7023</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Isotemp Agitador de placa caliente</td><td>Fisher Scientific</td><td>SP88850200</td><td></td></tr><tr><td>Línea de mosca: Gr5a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57592</td><td></td></tr><tr><td>Línea de mosca: Gr66a-Gal4</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>57670</td><td></td></tr><tr><td>Línea de mosca: HC-Gal4 (II)</td><td>Dr. Marco Gallio Lab</td><td></td><td>Un amable regalo</td></tr><tr><td>Línea de moscas: UAS-CsChrimson</td><td>Bloomington Drosophila Stock Center</td><td>55136</td><td></td></tr><tr><td>Línea de mosca: UAS-GtACR2/TM6B</td><td>Dr. Quentin Gaudry Lab</td><td></td><td>Un amable regalo</td></tr><tr><td>Flystuff 62-101 Harina de maíz amarilla (11,3 kg), amarilla, 11,3 kg/unidad</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-101</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 62-107 Levadura Seca Inactiva, 10 Kg, Copo Nutricional, 10 Kg/Unidad</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-107</td><td></td></tr><tr><td>Flystuff 66-103 Nutri-Fly Drosophila Agar, Gelidium, 100 Malla, 5 Kg (11.02 lbs)/Unidad</td><td>Genesee Scientific</td><td>66-103</td><td></td></tr><tr><td>FreeMascot OD 8+ 190 nm&ndash; 420 nm / 600 nm&ndash; Gafas de seguridad láser violeta/rojo/infrarrojo de longitud de onda de 1100 nm&nbsp;</td><td>Mascota Libre&nbsp;</td><td>B08LGMQ65S</td><td>comprado en Amazon</td></tr><tr><td>GoPro Hero8 Black</td><td>GoPro</td><td>6365359</td><td></td></tr><tr><td>filtros LEE 100 veces; 100 mm Infra Red #87 Filtro Infrarrojo de Poliéster B</td><td>& H Photo</td><td>LE8744</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de paso largo, vidrio coloreado, 50,8 x 50,8 mm, corte de 830 nm, RG830</td><td>Newport</td><td>FSQ-RG830</td><td></td></tr><tr><td>4-hidroxibenzoato de metilo, 99%, Thermo Scientific Chemicals</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>126960025</tr><tr><td>MicroWell Mini Tray 60 Pocillos, Perfil Bajo NS PS</td><td>Thermal Scientific&nbsp;</td><td>NUNC 439225</td><td>Las tapas se utilizan como "cubierta de plástico"</td></tr><tr><td>Olympus Plastics 24-160RS, 1000 &micro; L Olympus Puntas de pipeta ergonómicas de baja fijación, con bastidores, estériles, 8 gradillas de 96 puntas/unidad</td><td>Eppendorf</td><td>24-160RS</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm M Película de sellado</td><td>Heathrow Scientific</td><td>HS234526B</td><td>4 pulgadas x 125 pies</td></tr><tr><td>Cloruro de potasio, ACS, 99.0-100.5%,&nbsp;</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td></td><td></td>AA1159530</tr><tr><td>Prism</td><td>, GraphPad,</td><td>versión 9</td>, <td>software de análisis de datos</td></tr><tr>,<td>Samco Graduate Transfer Pipettes</td><td>Thermo Fisher Scientific&nbsp;</td><td>225</td><td></td></tr><tr><td>portaobjetos de</td> 3 mL <td>Fisher Scientific</td><td>12-544-2</td><td>&nbsp; Microscopio estereoscópico de 5 mm x 75 mm x 1,0 mm</td></tr><tr><td>Caja de espuma de poliestireno OLYMPUS CZ61 (27 cm de altura y veces; 22 cm de ancho y veces; 16 cm de longitud)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sacarosa</td><td>Fisher Scientific</td><td>225911 Sonda</td><td></td></tr><tr>de<td>temperatura de superficie</td><td>Jeringa Fluke</td><td>80PK-3A</td><td></td></tr><tr><td></td><td>BD Integra</td><td>305270</td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Tate & Lyle 457 Dextrosa, Tate & Lyle, Pow, Tate & Lyle 457 Dextrosa, Tate & Lyle, Polvo, 50 lbs/Unidad</td><td>Genesee Scientific</td><td>62-113</td><td></td></tr><tr><td>Termómetro de termopar de dígito grande calibrado trazable</td><td>por cple-parmer</td><td>&nbsp; UX-91210-07</td><td>Termómetro BigDigit Tipo K Trazable de Fisherbrand</td></tr><tr><td>LED Triple</td> LED azul de <td>estriborSupply</td><td>07007-PB000-D</td><td>470 nm</td></tr><tr><td>Triple LED rojo de estribor</td><td>LEDSupply</td><td>07007-PD000-F</td><td>627 nm</td></tr><tr><td>Tygon PVC Clear Tubing 1/4" ID, 3/8" OD, 5 pies de longitud&nbsp;</td><td>Compañía de suministros McMaster Carr &nbsp;</td><td>6516T21&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Iluminador IR Univivi, 850nm 12 LEDs Iluminador IR de gran angular para visión nocturna</td><td>Univivi</td><td>4331910725</td><td></td></tr><tr><td>Wakefield Thermal 25.4 mm Disipador de calor redondo Star LED Board - 882-100AB</td><td>Wakefield-Vette</td><td>882-100AB</td><td></td></tr><tr><td>Presentador inalámbrico</td><td>DinoFire Store B01410YNAM</td><td></td><td>comprado en Amazon</td></tr></tbody></table>

ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en drosophila melanogaster

Behavioral Assays for Optogenetic Manipulation of Neural Circuits in Drosophila melanogaster

Ensayo de preferencia posicional termotáctica optogenética de luz azul de una sola mosca Se probaron cuatro condiciones: luz ambiental sin suplementación de ATR (luz de la habitación, ATR -), luz de la habitación con suplementación de ATR (luz de la habitación, ATR +), luz azul sin suplementación de ATR (azul, ATR -) y luz azul con suplementación de ATR (azul, ATR +). Las tres primeras condiciones sirvieron como controles. En los experimentos de control, las moscas evitaron el lado de 31 °C. En luz az...

Ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster

Optogenetics has become a fundamental technique in neuroscience, enabling precise control of neuronal activity through light stimulation. This study ...

behavioral-assays-for-optogenetic-manipulation-neural-circuits

Research

Investigación

JoVE Journal

Neuroscience

Neurociencia

La optogenética permite el uso de la luz para manipular neuronas que están genéticamente modificadas para expresar opsinas específicas, proteínas sensibles a la luz cuya activación por luz desencadena un cambio en el estado de la neurona. En este trabajo describimos un abordaje optogenético en Drosophila utilizando la opsina Channelrhodopsin2. El protocolo de ejemplo presenta un conjunto de ensayos optogenéticos para estudiar los circuitos neuronales detrás del comportamiento de escape de la...

Drosophila Optogenética: un método para manipular circuitos neuronales

Este video muestra un estudio del comportamiento de navegación de las larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética de las neuronas sensoriales olfativas (ORNs). Las larvas transgénicas de Drosophila que expresan canales iónicos sensibles a la luz en los ORN se colocan en agarosa dentro de un campo de comportamiento. La estimulación optogenética con luz abre los canales, provocando una afluencia de cationes que desencadena la transmisión de la señal al cerebro, y se registra...

Comportamiento de navegación de larvas de Drosophila en respuesta a la estimulación optogenética de neuronas sensoriales olfativas

Codificados genéticamente herramientas optogenético permitir la manipulación no invasiva de neuronas específicas en...

Optogenético estimulación de comportamiento de escape en<em&gt; Drosophila melanogaster</em

Aquí se describe una prueba de preferencia de luz-oscuridad de Drosophila larva. Este ensayo proporciona información acerca de la regulación circadiana innata y de la luz photobehavior detección y tratamiento.

Ensayo Preferencia luz para estudiar innata y circadiano Photobehavior Regulado de<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas

Aquí se describe un protocolo para la manipulación optogenética de la actividad motoneuronal mientras monitoriza los cambios en la salida del motor (contracción muscular) en...

Optogenética perturbación de la actividad neuronal con la iluminación láser en semi-intacta<em&gt; Drosophila</em&gt; Las larvas in Motion

En este artículo de vídeo, se describe un ensayo automatizado para medir el efecto del hambre o la saciedad en el comportamiento de búsqueda de comida dependiente olfativo en la mosca adulta fruta Drosophila melanogaster.

Un ensayo de una sola mosca por el comportamiento de forrajeo en Drosophila

Describimos aquí una configuración conductual y un método de análisis de datos para analizar las respuestas olfativas de hasta 100 moscas del vinagre (Drosophila melanogaster). Este sistema puede ser utilizado con estímulos olfativos únicos o múltiples, y adaptable para la activación optogenética o el silenciamiento de subconjuntos neuronales.

Comportamientos olfativas ensayó mediante seguimiento informático de<em&gt; Drosophila</em&gt; En un olfatómetro de cuatro cuadrantes

Este protocolo analiza comportamiento navegación de larva de Drosophila en respuesta a la estimulación simultánea de la optogenetic de sus neuronas olfativas. Luz de longitud de onda de 630 nm se usa para activar las neuronas olfativas individuales expresando una rodopsina canal rojo-cambiado de puesto. Movimiento de larvas al mismo tiempo se realiza un seguimiento grabado digitalmente y analizados utilizando el software de medida.

Seguimiento de comportamiento larvario de Drosophila en respuesta a la estimulación de la Optogenetic de las neuronas olfatorias

Este protocolo introduce un ensayo de punto ligero para investigar el comportamiento fototáctico larvario de Drosophila. En este ensayo, se genera un punto de luz como estimulación de la luz, y el proceso de evitación de la luz larval es registrado por un sistema de imágenes basado en luz infrarroja.

Ensayo basado en puntos claros para el análisis de la fototaxis larval de Drosophila

El presente protocolo describe la generación de Drosophila melanogaster que expresa opsinas eNpHR2.0 o ReaChR en el corazón para imágenes de OCT y estimulación cardíaca optogenética. Se informan instrucciones detalladas para las imágenes de Drosophila OCT y la modulación de los latidos cardíacos, incluida la simulación de paro cardíaco restaurable, bradicardia y taquicardia en animales vivos en diferentes etapas de desarrollo.

Desarrollo de modelos de Drosophila melanogaster para imágenes y control optogenético de la función cardíaca

El protocolo presenta un método rentable y de alto rendimiento para evaluar la neurotoxicidad en la mosca de la fruta a través de la cuantificación de la disfunción locomotora como alternativa a los modelos tradicionales de mamíferos. Su objetivo es evaluar los efectos neurotóxicos de compuestos farmacéuticos, agentes ambientales o modificaciones genéticas utilizando un modelo sensible, reproducible y éticamente favorable.

Análisis conductual de la disfunción locomotora en Drosophila melanogaster como lectura de la neurotoxicidad

Aprende ensayos conductuales para manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster. Este método permite estudiar termotaxis y respuestas gustativas con precisión usando CsChrimson y GtACR2.

Ensayos conductuales para la manipulación optogenética de circuitos neuronales en Drosophila melanogaster

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