Name: Un modelo de vejiga in vitro de infección del tracto urinario asociada a catéter (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-24T12:30:00.000+00:00
Duration: 7 min 57 s
Description: Aprende a construir un modelo de vejiga in vitro para estudiar infecciones del tracto urinario asociadas a catéter. Este protocolo permite evaluar tratamientos antimicrobianos contra biofilms bacterianos y mejorar resultados clínicos.

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<table><tbody><tr><td>Extensión de cabezal de carga rápida 313 Bomba</td> peristáltica <td>Watson-Marlow</td><td>313</td><td>- extensión adicional del cabezal de la bomba</td></tr><tr><td>Bomba de velocidad variable con control manual 323S/D</td><td>Watson-Marlow</td><td>323S/D</td><td>Bomba peristáltica</td></tr><tr><td>3L Sacos de cama, estériles con grifos de palanca</td><td>Atención médica del Gran Oso&nbsp;</td><td>GDW173</td><td></td></tr><tr><td>Tubo de silicona curado con platino de 3 mm de diámetro interior</td><td>Fisher</td><td>10111801</td><td>Tubo de circuito AUM pequeño (conecte el tubo de la bomba a los modelos)</td></tr><tr><td>Tubo de silicona curado con platino de 5 mm de diámetro interior Fisher</td><td></td><td></td><td>10539201 Tubo de circuito AUM medio (conecte el tubo de la bomba al depósito AUM)</td></tr><tr><td>Cloruro de amonio (NH4Cl)</td><td>Fisher</td><td>11473713</td><td></td></tr><tr><td>sulfato de sodio anhidro (Na2SO4)</td><td>Fisher</td><td>11498717</td><td></td></tr><tr><td>Azlon Conector cónico&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>10712807</td><td>Se utiliza para conectar diferentes longitudes de tubería en el circuito AUM</td></tr><tr><td>Colgadores de bolsas de cama</td><td>Atención médica del Gran Oso&nbsp;</td><td>10705P</td><td></td></tr><tr><td>Abrazaderas de tubo de grifo de pellizco Bochem, 25 mm de diámetro</td><td>Fisher</td><td>11805101</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de calcio (CaCl2)</td><td>Fisher</td><td>10021681</td><td></td></tr><tr><td>Ácido cítrico monohidratado&nbsp;</td><td>Merck</td><td>C1909-500G</td><td>Se utiliza para eliminar la biopelícula cristalina de los modelos después de la experimentación</td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Pipetas de vidrio graduadas de clase B tipo 1</td><td>Fisher</td><td>11992168</td><td>Se utiliza para suministrar modelos de cuchillas in vitro con AUM a través de gelatina de tapón perforada</td></tr><tr><td></td><td>VWR</td><td>24360.233</td><td></td></tr><tr><td>Graphpad prism 10</td><td>GraphPad</td><td>V10.0</td><td>Software analítico utilizado para graficar los resultados de los modelos de vejiga in vitro y el análisis estadístico.</td></tr><tr><td>Medidor de pH de sobremesa Hanna HI 2211-02</td><td>Phillip Harris&nbsp;</td><td>PP00057414</td><td></td></tr><tr><td>Modelo in vitro vejiga&nbsp;</td><td>-</td><td>-</td><td>Equipo a medida como lo describieron anteriormente Nzakizwanayo et al. (2019).</td></tr><tr><td>Instillagel 6 mL gel lubricante</td><td>mydoctorshop.co.uk</td><td>40-006</td><td>Geles lubricantes utilizados en la sección 7.1.; hay otros proveedores disponibles.</td></tr><tr><td>Kartell Plastilab Conector cónico desigual</td><td>Fisher</td><td>11914289</td><td>Se utiliza para conectar tubos de diferentes diámetros</td></tr><tr><td>Agar MacConkey sin sal (deshidratado)</td><td>Fisher</td><td>10472643</td><td>Para la enumeración de colonias individuales de bacterias de enjambre, es decir, cloruro de magnesio Proteus mirabilis</td></tr><tr><td>hexahidratado (MgCl2.6H2O)</td><td>Fisher</td><td>10386743</td><td></td></tr><tr><td>fosfato monopotásico (KH2PO4)</td><td>Fisher</td><td>10573181</td><td></td></tr><tr><td>Nalgene Conector en forma de Y</td><td>Fisher</td><td>10186070</td><td>Se utiliza para ejecutar múltiples circuitos AUM desde un depósito AUM (1-4 modelos por tanque)&nbsp;</td></tr><tr><td>cloruro de potasio (KCl)</td><td>Fisher</td><td>10375810</td><td></td></tr><tr><td>Pyrex Botella de aspirador con enchufe lateral de vidrio esmerilado, capacidad: 5000 mL</td><td></td> Fisher <td>11347884</td><td>depósito AUM</td></tr><tr><td>Tapones de goma con un orificio, diámetro exterior: 37 mm, rojo, diámetro: 37 mm</td><td>Fisher</td><td>11517612</td><td>Se utiliza en el depósito AUM y para suministrar modelos in vitro con AUM</td></tr><tr><td>Catéter Foley francés 100 % silicona talla 14 con jeringa estéril de agua para inflado</td><td>Atención médica del Gran Oso&nbsp;</td><td>4833-0514</td><td></td></tr><tr><td>cloruro de sodio (NaCl)</td><td>Fisher</td><td>10735921</td><td></td></tr><tr><td>oxalato de sodio (Na2C2O4)</td><td>Fisher</td><td>10442211</td><td></td></tr><tr><td>Teknon Biocleanse concentrado biocida limpiador 5L&nbsp;</td><td>Fisher</td><td>12447580</td><td>Se utiliza para esterilizar modelos después de la experimentación</td></tr><tr><td>Citrato trisódico (Na3C6H5O7)</td><td>Fisher</td><td>11434993</td><td></td></tr><tr><td>caldo de soja triptona Urea</td><td>10198002</td><td></td><td>Fisher</td></tr><tr><td>(CH4N2O)</td><td>Fisher</td><td>10404185</td><td></td></tr><tr><td>Uro-Tainer M NaCl 0,9%</td><td>B.Braun</td><td>FB99833</td><td>Bolsa de irrigación vesical salina utilizada en la sección 7.2.&nbsp;</td></tr><tr><td>Watson-Marlow Pumpsil Tubo de silicona curado con platino de 1,6 mm de diámetro interior</td><td>Fisher</td><td>12406280</td><td>Tubo de circuito AUM grueso (para uso en bomba perstáltica)</td></tr></tbody></table>

un modelo de vejiga in vitro de infección del tracto urinario asociada a catéter

An In Vitro Bladder Model of Catheter-Associated Urinary Tract Infection

El éxito del funcionamiento del modelo de vejiga in vitro depende de la práctica de una buena técnica aséptica y de una observación cuidadosa de la turbidez de los medios a lo largo de la experimentación (Figura 3). Antes de la inoculación, el AUM estéril era de color amarillo pálido y transparente en la cámara central del modelo de vejiga in vitro (Figura 3A). El AUM en el depósito de medios debe permanecer claro durante toda la experimentación, ya que cualquier cambio de turbidez que ocurra puede indicar precipitación de sales de la solución o contaminación del medio. Si el AUM en el depósito de medios o en la tubería del circuito de medios se vuelve turbio o muestra un cambio drástico en el color, las réplicas deben descartarse y repetirse. Después de la inoculación, es claramente visible un aumento en la turbidez del AUM en la cámara central del modelo vesical in vitro (Figura 3B). Los cambios en la turbidez suelen ser más pronunciados en los organismos positivos a la ureasa, como P. mirabilis, pero aún deben ser visibles después de la inoculación en los organismos negativos a la ureasa. Después de que se inicia el flujo de AUM, a menudo se observa una reducción en la turbidez de AUM a medida que las células planctónicas se lavan, y no indica una falta de células viables en el modelo. La observación del nivel del medio en la cámara central también se puede utilizar para determinar el tiempo de bloqueo si se utilizan organismos positivos para la ureasa (Figura 3C). A medida que los modelos corren, el orificio del ojo y la punta del catéter deben ser completamente visibles para indicar el drenaje adecuado en las bolsas de desechos. Tras el bloqueo, el nivel de AUM en la cámara central se elevará por encima de los orificios oculares y la punta del catéter, lo que indica que el experimento está listo para cualquier lectura y terminación del punto final. Durante la experimentación, los efectos de la presión en el circuito de medios del modelo de vejiga in vitro pueden hacer que los modelos parezcan bloqueados. Si se sospecha de una obstrucción, verifique que el circuito AUM, el catéter y el tubo de la bolsa de residuos estén tensos antes de finalizar el ensayo, ya que cualquier posible burbuja de aire o torceduras en el tubo puede causar "esclusas de aire" e impedir que el catéter drene.
Durante los experimentos con modelos de vejiga in vitro , el muestreo planctónico puede proporcionar información valiosa sobre la dinámica de crecimiento dentro del modelo, así como sobre la progresión de CAUTI. El crecimiento celular, el pH y la formación de biopelículas se pueden monitorear a lo largo de la experimentación sin necesidad de terminar los modelos (Figura 4). Si se utilizan organismos ureasa positivos, los cálculos del tiempo de bloqueo se pueden utilizar como medida de la tasa de formación de biopelículas y se utilizan para comparar las propiedades de diferentes cepas bacterianas (Figura 4). La comparación de una cepa de tipo salvaje de P. mirabilis y un mutante LPS (inserción de mini-tn5 en waaC) demostró una extensión del tiempo hasta el bloqueo y, por lo tanto, una reducción de la formación de biopelículas en el mutante (Figura 4). Los microorganismos ureasa negativos no suelen bloquear los modelos de vejiga in vitro y, por lo tanto, se recomienda determinar un criterio de valoración establecido antes de la experimentación. En algunos casos, los microorganismos negativos a la ureasa pueden provocar la obstrucción del catéter. Por ejemplo, las cepas de ureasa negativa de Klebsiella pneumoniae pueden producir biopelículas mucoides extensas, sin embargo, estas suelen tardar mucho más que las biopelículas positivas para la ureasa en bloquear el drenaje, por lo que se sigue recomendando un criterio de valoración establecido.
La medición del pH a lo largo de la experimentación con modelos de vejiga también puede proporcionar información sobre las diferencias entre cepas, así como sobre el progreso de CAUTI. Si se utilizan organismos ureasa negativos, el pH en la cámara central del modelo de vejiga in vitro debe permanecer estable en gran medida durante toda la experimentación, aunque se esperan pequeñas fluctuaciones en el pH a medida que la dinámica de la población cambia en el transcurso del experimento. La inoculación de modelos in vitro con organismos ureasa positivos da como resultado un aumento significativo del pH con el tiempo, y el pH más alto generalmente se observa en el momento del bloqueo, donde se pueden observar lecturas de pH tan altas como ~8-9 (Figura 4B).
La enumeración de UFC/ml planctónica es un componente importante del modelado de la vejiga in vitro , ya que permite a los operadores evaluar si la inoculación ha sido exitosa y monitorear el progreso de la experimentación. La medición de UFC/ml al final de la experimentación puede resaltar cualquier diferencia en la colonización de la vejiga entre diferentes cepas bacterianas. Al comparar la cepa mutante mini-Tn5 de P. mirabilis con la de tipo salvaje, se observó una reducción significativa de UFC/mL en el momento del bloqueo (Figura 4C). Además, la enumeración de las UFC a partir de las biopelículas en la superficie del catéter y la cuantificación de la biomasa de la biopelícula pueden proporcionar información sobre la capacidad de diferentes patógenos para colonizar el tracto urinario cateterizado. Se utilizaron tinciones de violeta cristalino para determinar las diferencias en la formación de biopelícula entre una cepa HI4320 de P . mirabilis de tipo silvestre y los aislados pasados en clorhexidina (Figura 5). Las mediciones de densidad óptica a 595 nm demostraron que los aislados pasados en clorhexidina mostraron una reducción en la formación de biopelículas en comparación con el tipo salvaje y los controles pasados en ausencia de clorhexidina.
Dado que el objetivo del modelo de vejiga in vitro es replicar con precisión el nicho de CAUTI, los modelos también se pueden utilizar para estudiar los efectos de las terapias antimicrobianas destinadas a tratar CAUTI en un entorno clínicamente relevante. En el caso de los organismos con ureasa positiva, la comparación de los tiempos de bloqueo de los modelos tratados con los modelos no tratados puede proporcionar información útil sobre la eficacia del tratamiento. El tratamiento de modelos de vejiga in vitro inoculados con P. mirabilis con una solución de irrigación vesical con clorhexidina al 0,02% extendió significativamente el tiempo hasta la obstrucción en comparación con los modelos que no se trataron o se trataron con solución salina al 0,9% (Figura 6A). Además, el modelo de vejiga in vitro se puede utilizar para estudiar la actividad bactericida de las terapias antimicrobianas. El seguimiento de los cambios en las UFC/ml de las células planctónicas y asociadas a la biopelícula después del tratamiento antimicrobiano puede indicar si los tratamientos son eficaces. El tratamiento de los modelos de vejiga in vitro inoculados con P. mirabilis demostró una reducción de &gt;7 log en las UFC/ml planctónicas inmediatamente después del tratamiento, en comparación con los modelos no tratados y con riego salino del 0,9% cuando se aplicaron según las instrucciones del fabricante (Figura 6B).
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema de los principales componentes del modelo de vejiga in vitro . (A) El modelo de vejiga (sistema de drenaje cerrado): (1) cámara de vidrio de doble pared que simula la vejiga (2) entrada de medios, AU se suministra a través de una bomba peristáltica a la cámara interna del modelo de vejiga (3) entrada de agua suministrada a través de un baño de agua circulante a la cámara exterior (4) salida de agua (5) catéter Foley, insertado en la cámara interna (6) punto de conexión de lúmen de drenaje; Punto de conexión para bolsa de residuos/bolsas de riego (7) Bolsa de drenaje que recoge el flujo de salida de orina. (B) Esquema que representa la configuración del modelo de vejiga in vitro y la dirección del flujo de medios y agua a través del modelo. La orina artificial se almacena en un depósito de medios (1) a temperatura ambiente y se suministra al modelo a través de una bomba peristáltica (2) a un caudal constante de ~ 0,75 mL min-1 durante la duración del experimento. El medio fluye hacia la cámara central del recipiente de vidrio de doble pared que representa la vejiga (3) y drena a través del orificio ocular de un catéter de Foley (4) en una bolsa de drenaje (5), completando el sistema de drenaje cerrado estéril. El modelo de vejiga in vitro se mantiene a una temperatura constante de 37 °C a través de un baño de agua circulante (6), que fluye a través de la cámara exterior del recipiente de vidrio de doble pared. Las líneas discontinuas representan los tubos de silicona y las flechas representan la dirección del flujo. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig02.jpg"> 
Figura 2: Corte de catéteres urinarios para procesar las células asociadas al biofilm. Puntos de ejemplo en un catéter urinario para la disección para la cuantificación posterior de la biopelícula. (A) Los catéteres se seccionan primero latitudinalmente en la región de 8 cm proximal a la punta/orificios oculares (donde se observa la mayor parte de la formación de biopelícula). Las secciones de 1 cm se retiran con bisturí, evitando generalmente la región que contiene el balón del catéter desinflado debido a las dificultades en la reproducibilidad del procesamiento (1-3). (B) Una vez que los catéteres se seccionan inicialmente en piezas de 1 cm, se realiza otro corte longitudinal en el lumen central para exponer cualquier biopelícula presente para una mayor cuantificación de la biopelícula, es decir, enumeración de UFC/mL de tinción de violeta cristalino. Las líneas discontinuas representan puntos de disección. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig03.jpg"> 
Figura 3: Etapas de un experimento de modelo de vejiga in vitro . Imágenes de la cámara central modelo de vejiga in vitro , a lo largo de diferentes etapas de experimentación. (A) AUM en la cámara central modelo de vejiga in vitro antes de la inoculación. Los medios en la cámara central son completamente transparentes, lo que indica una esterilización exitosa, y la punta del catéter y los orificios de los ojos son visibles por encima de la línea de medios, lo que indica que el catéter se está drenando con éxito. (B) Medios en la cámara central modelo de vejiga in vitro después de la inoculación con P. mirabilis (4 h después de la inoculación). El éxito de la inoculación está indicado por el aumento de la turbidez del medio. La visibilidad de la punta del catéter y los orificios oculares indican que el AUM se está drenando con éxito a través del catéter y que no se ha producido ninguna obstrucción. (C) Un ejemplo de un modelo de vejiga in vitro bloqueada. La inoculación con P. mirabilis y la posterior formación de biofilm y mineralización han dado lugar a la obstrucción de los orificios oculares del catéter, impidiendo el drenaje y haciendo que el nivel de medios en la cámara central se eleve por encima de la punta del catéter. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig04.jpg"> 
Figura 4: Mediciones de punto final para un modelo de vejiga in vitro hasta la obstrucción. Ejemplo de mediciones de punto final en el momento del bloqueo de un modelo de vejiga in vitro inoculado con una cepa clínica de P. mirabilis, RS47 (WT), y una cepa mutante con formación de biopelícula atenuada, RS47-2 (mutante). (A) Tiempo de bloqueo (h) de WT y cepas mutantes de P. mirabilis. (B) pH de modelos de vejiga in vitro en el momento de la obstrucción. (C) UFC/mL de células planctónicas en cámara modelo de vejiga in vitro en el momento de la obstrucción. Todos los datos representan la media de cinco réplicas biológicas. Las barras de error muestran el error estándar de la media (SEM). *p ≤ 0,05; **p ≤ 0.01. Esta figura ha sido modificada a partir de Clarke et al.46. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig05.jpg"> 
Figura 5: Mediciones celulares asociadas a biofilm a partir del modelo de vejiga in vitro . Cuantificación de la formación de biopelículas de P. mirabilis , comparando la cepa de tipo salvaje HI4320 con poblaciones adaptadas con o sin clorhexidina (CHD) mediante tinción con violeta cristalino y medición de la densidad óptica (OD) a 595 nm. WT: P. mirabilis HI4320; 1, 3, 5: controles de paso sin exposición a la cardiopatía coronaria; 2, 4, 6: HI4320 conducido en 4 μg/mL CHD. Todos los datos representan la media de cinco réplicas biológicas. Las barras de error muestran SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67966/67966fig06.jpg"> 
Figura 6: Mediciones de modelos de vejiga in vitro después de un tratamiento antimicrobiano. Se tomaron muestras planctónicas de un modelo de vejiga in vitro inoculado con P. mirabilis, luego de la irrigación con una solución antimicrobiana de clorhexidina al 0,02% (100 mL) o un control salino al 0,9%. (A) Tiempo de obstrucción de los modelos de vejiga in vitro después de la irrigación. (B) UFC/mL planctónico inmediatamente después del tratamiento de riego. Todos los datos representan la media de cinco réplicas biológicas. Las barras de error muestran SEM. *p ≤ 0,05; **p ≤ 0,01; *p ≤ 0,0001. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67966/67966fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Un modelo de vejiga in vitro de infección del tracto urinario asociada a catéter

Catheter-associated urinary tract infections (CAUTIs) are among the most common healthcare-associated infections. Biofilm formation on urinary catheters ...

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Investigación

JoVE Journal

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