Identificación de microglía y macrófagos infiltrantes periféricos en la médula espinal lesionada mediante citometría de flujo

Nuestra investigación identifica la microglía y los macrófagos infiltrantes en la lesión de la médula espinal para aclarar su papel en la neuroinflamación mediante citometría de flujo optimizada. La citometría de flujo y la centrifugación en gradiente de densidad son clave para aislar y fenotipar las células inmunitarias del sistema nervioso central con alta especificidad y eficiencia. Distinguir microglía y macrófagos morfológicamente similares, minimizando la pérdida de células durante el aislamiento, y la microespecificidad inferior en microambientes de lesiones dinámicas siguen siendo obstáculos clave. Los métodos existentes no logran separar de manera confiable la microglía residente de los macrófagos infiltrantes. Nuestro enfoque basado en marcadores resuelve esta limitación crítica en los estudios de lesiones de la médula espinal.

[Presentador] Para comenzar, analice el tubo de control del isotipo utilizando el citómetro de flujo con el software compatible. Ajuste los voltajes de dispersión directa y dispersión lateral para colocar la población de celdas dentro de un rango apropiado. Configure dos gráficos adicionales, uno con IgG APC en el eje X e IgG PE en el eje Y, otro con IgG-FITC en el eje X e IgG APC-Cy7 en el eje Y. Luego, ajuste los voltajes del canal de fluorescencia para IgG APC, IgG PE, IgG FITC e IgG APC-Cy7 para posicionar la población celular dentro de 10 a la potencia de tres de la región doble negativa. Después de confirmar los voltajes optimizados usando el tubo de control de isotipo, conserve todos los ajustes. Proceder a analizar los tubos experimentales teñidos con anticuerpos. Establezca un gráfico con CD11b PE en el eje X y dispersión lateral en el eje Y. Configure otro gráfico con CD68 FITC y CCR7 APC-Cy7. Usando el control de isotipo como referencia, delinee la región positiva para CD11b y defínela como la puerta P1. Seleccione el gráfico CD68 FITC y CCR7 APC-Cy7. Haga clic con el botón derecho para abrir Mostrar población y asigne la columna F4 a P1. Después de adquirir los datos, ajuste la compensación de fluorescencia según sea necesario. Analizar y registrar el porcentaje de poblaciones celulares CD11b CD68 CCR7 positivas y CD11b CD68 positivas CCR7 negativas. Comience a analizar los tubos experimentales utilizando los ajustes de voltaje del tubo de control de isotipo. Establezca un gráfico con CD45 APC y CD11b PE. A continuación, configure dos gráficos con CD68 FITC y CCR7 APC-Cy7. Adquiera 50.000 eventos por muestra y ajuste la compensación de fluorescencia después de la recopilación de datos. En los gráficos de pseudocolor de CD45 y CD11b, identifique y analice las regiones de células CD45 positivas para CD11b, CD45 negativas bajas y CD11b positivas para CD45 altas. Luego, analice las poblaciones CD68 positivas para CCR7 y CD68 positivas para CCR7 negativas dentro de cada región. Integre todos los análisis para determinar el porcentaje de microglía y macrófagos similares a M1 y M2 en las regiones definidas. Inicie el software de análisis de citometría de flujo. Arrastre los archivos de experimentos de citometría de flujo a la sección Todas las muestras de la interfaz. Haga doble clic en la muestra de control de isotipo para abrir un gráfico de puntos bidimensional. Seleccione FSCA para el eje X y SSCA para el eje Y, haga clic en el botón de puerta rectangular y utilícelo para seleccionar el área excluyendo los desechos celulares. Haga doble clic en el área cerrada para abrir un nuevo gráfico de histograma. A continuación, seleccione FITC para el eje X e histograma para el eje Y. Haga clic en el botón de puerta de región para definir el umbral entre señales fluorescentes negativas y positivas. Para cada uno de los cuatro anticuerpos fluorescentes, determine el umbral entre señales negativas y positivas utilizando la muestra de control de isotipo. Cambie secuencialmente el fluorocromo del eje X a PE-APC y APC-Cy7 manteniendo el histograma del eje Y. Utilice la herramienta de puerta de región en cada histograma para finalizar las puertas para distinguir las señales fluorescentes negativas y positivas para los cuatro anticuerpos. A continuación, haga doble clic en la muestra experimental para abrir un diagrama de puntos. Seleccione FSCA para el eje X y SSCA para el eje Y, haga clic en el botón de puerta rectangular para proteger la población después de eliminar los escombros. Haga doble clic en la región cerrada para abrir un nuevo diagrama de puntos. Seleccione CD11b PE para el eje X y SSCA para el eje Y. Haga clic en el botón de puerta rectangular y use el umbral PE del control de isotipo para definir la puerta positiva para CD11b. Ahora haga doble clic en la región positiva para CD11b para abrir otro diagrama de puntos, seleccione CD68 FITC para el eje X y CCR7 APC-Cy7 para el eje Y. Haga clic en el botón de puerta cruzada y use los umbrales FITC y APC-Cy7 derivados de isotipos para categorizar las células en tipos similares a M1 y similares a M2. La proporción de células CD45 CD45 CD11b positivas para CD68 positivas para CCR7 aumentó significativamente en el grupo de vehículos de lesión de la médula espinal, o LME, en comparación con el grupo simulado, y el tratamiento con CRID3 no alteró este nivel. La proporción de células CD45 negativas para CD11b positivas para CD68 positivas para CD68 positivas fue significativamente mayor en el grupo de vehículos de LME en comparación con el simulado, y se redujo significativamente después del tratamiento con CRID3. Las proporciones de células CD11b positivas para CD68 positivas para CCR7 aumentaron significativamente en el grupo de vehículos de LME en comparación con el simulado y disminuyeron significativamente después del tratamiento con CRID3. CD11b positivo, CD68 positivo, CCR7 negativo y CD45 negativo, CD11b bajo positivo, CD68 positivo CCR7 negativo, proporciones celulares disminuyeron significativamente en ambos grupos de vehículos de LME, en comparación con el simulado, y aumentaron después del tratamiento con CRID3.