Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

Este protocolo demuestra la técnica de sangre punto libre de células, una plataforma de inmunoensayo adaptable, accesible y asequible desarrollada en respuesta a la pandemia de COVID-19. Los métodos de inmunoensayo de referencia existentes incluyen variaciones de la técnica ELISA y ensayos de flujo lateral. Ha habido un interés significativo en el desarrollo de nuevos inmunoensayos utilizando tecnologías como proteínas reportadas divididas, interfaces electroquímicas y nanopartículas coloidales.

El desafío es que la mayoría de los inmunoensayos de referencia son inaccesibles para las comunidades no centralizadas debido a la dependencia de componentes y equipos moleculares costosos y sofisticados. Esta novedosa técnica de inmunoensayo CFDB puede adaptarse rápidamente a los brotes emergentes. Utiliza equipos básicos de laboratorio y se basa completamente en componentes moleculares que se pueden producir internamente y en entornos de bajos recursos.

Para empezar, obtenga la secuencia de proteínas de la base de datos UniProt utilizando el código de acceso P0DTC9. Código en la optimización de la secuencia para la expresión basada en ecoli mediante la herramienta de optimización de código IDT. Inserte la secuencia optimizada en una plantilla de SnapGene para la estructura troncal de la construcción de expresión antes de solicitar la secuencia optimizada para la síntesis comercial como un fragmento de ADN monocatenario resuspendido en agua.

Realice una prueba inicial de expresión a escala de cinco microlitros añadiendo un 10% de producto de PCR a la reacción libre de células ecoli BL21 en un tubo de PCR. Incubar la reacción sin agitar a 30 grados centígrados durante 15 horas. Evalúe la calidad de expresión de la proteína de la nucleocápside o del antígeno NP cargando un microlitro de la reacción libre de células en un gel de página SDS al 12% y transfiéralo a una membrana de nitrocelulosa para la transferencia occidental.

Ensamble una reacción libre de células a escala de un mililitro utilizando un producto de plantilla de expresión lineal purificada de 15 nanomolares para el ensayo de transferencia de puntos sin células Interincube la mezcla de expresión en un tubo cónico de 15 mililitros con agitación a 80 RPM durante 15 horas a 30 grados Celsius. Después de evaluar la calidad de la expresión utilizando Western blot y alícuotas de 50 microlitros de la mezcla de expresión, almacene las alícuotas a menos 20 grados Celsius. Utilice una imagen de cuadrícula maestra como se muestra con un patrón de seis por seis centímetros que contiene círculos de 12 por 12, cada uno con un diámetro de dos milímetros, diseñado para coincidir con la capacidad de detección de una placa de 96 pocillos.

Después de imprimir la rejilla maestra, intercala firmemente entre dos capas de película adhesiva para techo de placa PCR, corte el sándwich a medida a lo largo de los bordes exteriores de la rejilla. Con un punzón de biopsia de dos milímetros, ahuece cada círculo marcado en la cuadrícula. Corte un trozo de membrana de nitrocelulosa de 6,5 por 6,5 centímetros, colóquelo debajo de la rejilla maestra sobre una superficie limpia y asegúrelo con cinta adhesiva.

Con un rotulador, marque las posiciones de los círculos más exteriores de la membrana de nitrocelulosa que se utilizarán como guía para cortar la membrana después de la detección de la muestra. Diluya las muestras de suero de una a 10 en PBS. Con una micropipeta, dispense volúmenes de 0,4 microlitros por triplicado de cada muestra en la membrana de nitrocelulosa en posiciones de rejilla predeterminadas.

Deje que las muestras manchadas se unan y se sequen a temperatura ambiente durante 10 minutos. Con unas pinzas, recupere con cuidado la membrana de nitrocelulosa y córtela a lo largo de los círculos exteriores marcados. Transfiera la membrana a una placa de Petri de 10 centímetros que contenga 10 mililitros de solución de bloqueo.

Incubar a temperatura ambiente durante 30 minutos mientras se agita suavemente a 100 RPM. Retire la alícuota de 50 microlitros de la mezcla de expresión de antígeno libre de células del congelador y, después de descongelar, agréguela a cinco mililitros de solución bloqueante en una placa de Petri de 10 centímetros. Transfiera la membrana directamente a esta solución que contiene antígeno e incube a temperatura ambiente durante una hora, agitando a 100 RPM.

Después de una hora, enjuague y lave la membrana en TBST que contenga 0.05%Tween 20. A continuación, agregue 10 mililitros de tampón de bloqueo que contenga 10 microgramos por mililitro de SpyCatcher purificado, dos ápices, dos proteínas, a la membrana y coloque la membrana en un plato que contenga SpyCatcher ápice. Incubar durante una hora agitando a 100 rpm: Después de enjuagar la membrana con solución salina tamponada con tris o TBS, lavar dos veces durante cinco minutos en TBST, seguido de un enjuague final en TBS.

Pegue y asegure un trozo de parafilm sobre una superficie de trabajo limpia cerca del instrumento de adquisición de imágenes de mancha. Retire el exceso de líquido golpeando la membrana y, con unas pinzas, colóquela encima del parafilm. Agregue inmediatamente tres mililitros de quimioluminiscencia mejorada o solución ECL en la parte superior de la membrana e incube a temperatura ambiente durante exactamente 90 segundos.

Después de secar la membrana, transfiérala a un instrumento de imagen compatible con la quimioluminiscencia. Utilice la función de análisis de imágenes del instrumento para obtener intensidades puntuales, incluso para tres posiciones en blanco en la membrana de nitrocelulosa. Mantenga un volumen de medición constante por punto.

Exporte los datos a una hoja de cálculo, asegurando el etiquetado correcto de cada posición de punto. Calcule la media y la desviación estándar de las intensidades puntuales por triplicado. Reste el fondo de la membrana de nitrocelulosa de todas las mediciones de la muestra.

A continuación, utilice la ecuación dada para obtener un valor de corte para la interpretación de los resultados positivos o negativos. Por último, represente los datos cortados sustraídos en un gráfico de barras. Se realizó un ensayo de transferencia de puntos sin células en la Sarah humana comercial precaracterizada, y en esta figura se presenta una imagen de la transferencia, junto con el gráfico de intensidad de señal correspondiente.

El ensayo de transferencia de puntos sin células identificó con éxito todas las muestras de control negativas y la mayoría de las muestras positivas. Las pruebas independientes del ensayo de transferencia de puntos libres de células en el Laboratorio Nacional de Microbiología identificaron correctamente las 12 muestras negativas y las 12 positivas de los pacientes, lo que confirma su solidez. El ensayo de transferencia de puntos libres de células también detectó respuestas de anticuerpos en el hámster Sarah infectado con SARS-CoV-2, con señales positivas observadas en 18 de las 24 muestras posteriores a la infección recogidas cinco días después de la reinfección, mientras que todas las muestras previas a la infección siguieron siendo negativas.