Name: Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:20:00.000+00:00
Duration: 8 min 21 s
Description: Aprende la técnica de cell-free dot blot para inmunoensayo accesible y económico en sueros humanos y animales. Este método permite detectar respuestas de anticuerpos en entornos con recursos limitados.

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<ol><li>Carter, L. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Assay+techniques+and+test+development+for+COVID-19+diagnosis%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Cent+Sci%22%5BJournal%5D)">Assay techniques and test development for COVID-19 diagnosis.</a> ACS Cent Sci. 6, 591-605 (2020).</li>
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<li>Norouzi, M., Panfilov, S., Pardee, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-efficiency+protection+of+linear+DNA+in+cell-free+extracts+from+Escherichia+coli+and+Vibrio+natriegens%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">High-efficiency protection of linear DNA in cell-free extracts from Escherichia coli and Vibrio natriegens.</a> ACS Synth Biol. 10 (7), 1615-1624 (2021).</li>
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</ol>

<table><tbody><tr><td>1 kb escalera de ADN</td><td>NEB</td><td>N3232</td><td>Utilizado como marcador de tamaño para geles de agarosa</td></tr><tr><td>20 Aminoácidos</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>LAA21-1KT</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución B Punzón de</td></tr><tr><td>biopsia de 2 mm&nbsp;</td><td>Integra Miltex&nbsp;</td><td>33-31-P/25</td><td>Para la preparación de</td></tr><tr><td>clorhidrato de ácido 5-aminolevulínico de la rejilla maestra CFDB&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A3785</td><td>Precursor de hemo para la inducción de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Polvo de agarosa</td><td>BioShop</td><td>AGA002</td><td>Para el análisis electroforético del ADN</td></tr><tr><td>Anti-SARS-CoV2-Nucleocápside anticuerpo</td><td>Sinobiológico</td><td>40588-T62</td><td>Para la detección WB del antígeno NP producido libremente</td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc&nbsp; XRS+</td><td>Bio-Rad</td><td>N/A Instrumento</td><td>generador de imágenes en gel</td></tr><tr><td>Concentradores centrífugos</td><td>Cytiva</td><td>28-9323-60</td><td>Para la concentración y el intercambio tampón de proteínas</td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>EP022628257</td><td>Para la recolección de cultivos bacterianos</td></tr><tr><td>Coenzima&nbsp; Un hidrato de sal de sodio (CoA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C3144</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución A</td></tr><tr><td>Color pre-teñido estándar (amplio rango)</td><td>NEB</td><td>P7719</td><td>Utilizado como marcador de tamaño para geles SDS-PAGE</td></tr> Panel <tr><td>de suero Covid-19</td><td>RayBiotech</td><td>CoV-PosSet</td><td>Sueros precaracterizados para la verificación y optimización de reactivos/condiciones</td></tr> <tr><td>CFDBD-(&menos;)-3-Sal disódica del ácido fosfoglicérico (3-PGA)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P8877</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución B</td></tr><tr><td>Dithiothreitol (DTT)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10197777001</td><td>Componente de los tampones</td></tr><tr><td>E. coli 5-alfa</td><td>NEB</td><td>C2987&nbsp;</td><td>para la preparación de plásmidos</td></tr><tr><td>E. coli BL21&nbsp;</td><td>NEB</td><td>C2530&nbsp;</td><td>Para la preparación de lisados libres de células</td></tr><tr><td>E. coli BL21 (DE3)</td><td>NEB</td><td>C2527&nbsp;</td><td>Para la expresión de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Comprimido inhibidor de la proteasa sin EDTA</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>11836153001</td><td>Un componente del tampón de lisis de E. coli</td></tr><tr><td>Eppendorf&nbsp; Nuevo Brunswick &nbsp; Incubadora Innova 43/43R Agitador</td><td>Eppendorf</td><td>EPM1320</td><td>Incubadora para el cultivo de células de E. coli para la expresión de proteínas y la preparación de lisado libre de células</td></tr><tr><td>Ácido folínico</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>47612</td><td>Un componente de la solución de reacción libre de células A</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G9012</td><td>Componente de SpyCatcher2-Apex2 tampón de almacenamiento</td></tr><tr><td>Cloruro de Hemin&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H9039&nbsp;</td><td>Para la suplementación con hemo de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Peróxido de hidrógeno 30%</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H1009</td><td>Para la fabricación de reactivos ECL</td></tr><tr><td>Software de laboratorio de imágenes</td><td>Bio-Rad</td><td>1709690</td><td>para el instrumento de imagen ChemiDoc gel &nbsp;</td></tr><tr><td>Isopropil-b-D-1-tiogalactopiranósido &nbsp;</td><td>Bioshop</td><td>IPT001</td><td>Para la inducción de SpyCatcher2-Apex2 expressikon</td></tr><tr><td>Sulfato de Kanamicina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>60615</td><td>Para la preparación de SpyCatcher2-Apex2 cultivo bacteriano</td></tr><tr><td>LB agar BioShop</td><td></td><td>LBL406</td><td>Para el crecimiento de E. coli</td></tr><tr><td>Caldo LB</td><td>BioShop</td><td>LBL407</td><td>Para el crecimiento de E. coli</td></tr><tr><td>luminol&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A4685</td><td>Para la fabricación de reactivo ECL</td></tr><tr><td>Lisozima</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>L6876</td><td>Para la lisis de células bacterianas</td></tr><tr><td>Acetato de magnesio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M5661</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución B</td></tr><tr><td>NEBExpress Resina Ni&nbsp;</td><td>NEB</td><td>S1428S</td><td>Para la purificación de SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Leche en polvo desnatada</td><td>Bioshop</td><td>SKI400</td><td>Para el bloqueo de membranas WB y CFDB</td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>Bemis</td><td>2099-1337410</td><td>Para la incubación ECL de transferencias CFDB</td></tr> ácido <tr><td>p-cumárico&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>C9008</td><td>Para la fabricación del reactivo ECL</td></tr><tr><td>pET24b-SpyCatcher2-Apex2 plásmido</td><td>Pardee Laboratorio</td><td>N/A</td><td>Utilizado para la expresión de la proteína SpyCatcher2-Apex2</td></tr><tr><td>Placa de Petri</td><td>Fisherbrand</td><td>FB0875712</td><td>Contenedor para incubación de membrana WB y CFDB&nbsp;</td></tr><tr><td>Solución salina tamponada con fosfato 10%</td><td>BioShop</td><td>PBS405</td><td>Componente de los tampones</td></tr><tr><td>Glutamato</td> de potasio <td>Sigma-Aldrich</td><td>G1501</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución B</td></tr><tr><td>Oxalato de potasio monohidratado (ácido oxálico)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>223425</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución A</td></tr><tr><td>Gel prefabricado SDS-PAGE</td><td>BioRad</td><td>4561036EDU</td><td>Para el análisis electroforético de la proteína</td></tr><tr><td>Q5 ADN polimerasa de alta fidelidad&nbsp;</td><td>NEB</td><td>M0491&nbsp;</td><td>Para la amplificación por PCR de LETS</td></tr><tr><td>Kit de purificación QIAquick PCR&nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>28106</td><td>Para la purificación de LETs</td></tr><tr><td>Juego de soluciones de ribonucleótidos</td><td>NEB</td><td>N0450S</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución A</td></tr><tr><td>Leche desnatada en polvo</td><td>BioShop</td><td>SKI400</td><td>Se utiliza como agente bloqueante para Western blot y CFDB</td></tr><tr><td>Cloruro de sodio</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9625</td><td>Un componente de los tampones de purificación de proteínas</td></tr><tr><td>Sonicator</td><td>Qsonica</td><td>Q500</td><td>Para la lisis de células bacterianas</td></tr><tr><td>Espermidina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S2626</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución A</td></tr><tr><td>Filtro de jeringa</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>SLGSR33SS</td><td>Para la esterilización de tampones y soluciones</td></tr><tr><td>Termociclador</td><td>BioRad</td><td>T100</td><td>Instrumento para la incubación de reacciones de PCR</td></tr><tr><td>ARN de transferencia (ARNt)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>R8759</td><td>Un componente de la solución</td></tr><tr><td>salina tamponada</td> de reacción libre A Tris <td>Thermo Scientific</td><td>J60764. K2</td><td>Componente de tampón de lavado WB y CFDB</td></tr><tr><td>Trizma base</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>T1503</td><td>Para hacer tampón tris</td></tr><tr><td>Tunair SS-5012 Matraz de medio deflector para agitar, 2,5 L</td><td>Cole-Parmer</td><td>RK-01835-39</td><td>Recipiente para el cultivo de células de E. coli para la expresión de proteínas y la preparación de lisado libre de células</td></tr><tr><td>Tween-20</td><td>BioShop</td><td>TWN510</td><td>Componente del tampón de lavado WB y CFDB</td></tr><tr><td>Pinza</td><td>Almedic</td><td>7728-A10-100</td><td>Para el manejo de la membrana CFDB NC</td></tr><tr><td>Espectrofotómetro UV-Vis</td><td>Thermo Scientific</td><td>13400518</td><td>Se utiliza para la medición de la concentración de ácidos nucleicos y ADN y el cultivo bacteriano OD</td></tr> Panel <tr><td>de referencia internacional de la OMS para la inmunoglubulina anti-SARS-CoV-2</td><td>NISBC</td><td>20/268</td><td>Sueros precaracterizados para la verificación y optimización de reactivos/condiciones</td></tr> <tr><td>CFDB&beta;-Nicotinamida adenina dinucleótido hidrato (NAD)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>10127965001</td><td>Un componente de la reacción libre de células Solución A</td></tr></tbody></table>

cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

Cell-Free Dot Blot as a Practical and Adaptable Immunoassay Platform for the Detection of Antibody Response in Human and Animal Sera

Amplificación por PCR de la plantilla de expresión lineal para el antígeno diana Para amplificar por PCR el LET NP del SARS-CoV-2, se utilizaron cebadores universales Ter directos e inversos como se describe en la sección 1.2 del protocolo y se comprobó 1 μL del producto en un gel de agarosa (Figura 4) antes de proceder a la purificación del producto PCR.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files...

Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

The string of global pathogenic outbreaks over the past two decades has highlighted the importance of serosurveillance strategies. Immunoassay platforms ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Gracias a la tecnología Luminex Corporation microesfera xMAP, hemos desarrollado el inmunoanálisis fluorométrico multiplexada (MFIA) para la vigilancia serológica de las diversas especies de animales de laboratorio. El MFIA es un microarray de suspensión donde se covalentemente con el antígeno, tejido de control o inmunoglobulinas vinculado a microesferas de poliestireno con código de color. El método de prueba MFIA, así como diversos temas de solución de problemas se aborda.

Multiplexado inmunoensayo fluorométrico Metodología de prueba y solución de problemas

Este video describe una técnica de inmunoensayo que utiliza perlas magnéticas fluorescentes o microesferas junto con diferentes antígenos para detectar simultáneamente varios isotipos de anticuerpos en una muestra de suero. El ensayo es útil para comprender la seroconversión durante una infección o después de la vacunación.

Ensayo de inmunoperlas multianalitos: una técnica de inmunoensayo basada en flujo para la detección simultánea de múltiples subtipos de anticuerpos en muestras de suero humano

Este protocolo describe el desarrollo de dos anticuerpos monoclonales (mAb) de clase IgG fuertemente reactivos a la mioglobina de los cetáceos. Estos mAbs se aplican en una tira reactiva inmunocromatográfica de oro coloidal basada en el formato sándwich para diferenciar el Mb de los cetáceos de la foca y otros animales.

Desarrollo de una tira de prueba inmunocromatográfica basada en el oro coloidal para la detección de Cetáceos mioglobina

La sangre periférica humana se utiliza habitualmente para la evaluación de la respuesta inmunitaria humoral. En este trabajo, se describen los métodos para aislar las células B humanas de la sangre periférica, diferenciar las células B humanas en células B secretoras de anticuerpos (Ab) en cultivo y enumerar el total de IgM- e IgG-ASC mediante un ensayo ELISpot.

El aislamiento, diferenciación y cuantificación de Human secretoras de anticuerpos células B de sangre: ELISpot como una lectura funcional de la inmunidad humoral

Demostramos una tecnología de chip de complemento para realizar inmunoensayos sandwich multiplexados Cruz-reactivity-free simplemente chasquear dos diapositivas. Un aparato de presión se utiliza para transferir confiablemente reactivos de microarray de microarrays. El chip del broche de presión puede utilizarse reacciones bioquímicas que requieren colocalización de diferentes reactivos sin contaminación cruzada.

Rápido Chip para Cruz-reactivity-libre y observador de tiro multiplexado inmunoensayos de Sandwich

Aquí se demuestra un detallado proceso de análisis de cuantitativo dot blot (QDB) determinando el contenido absoluto de una proteína específica, capsulando la proteína actina, gelsolina-como (CAPG), en tres tejidos de ratón diferente. Demostrar un alto rendimiento, técnica de immunoblot conveniente y cuantitativa para la validación de biomarcadores a nivel celular y tejido.

Alto rendimiento, la absoluta determinación del contenido de una proteína seleccionada a nivel de tejido con punto cuantitativo Blot análisis (QDB)

En este artículo se describe un protocolo para caracterizar las respuestas de isotipo de inmunoglobulina (Ig) T dependientes y T independientes en ratones usando ELISA. Este método se usa solo o en combinación con el flujo cytometry permitirá a los investigadores identificar las diferencias en las respuestas de isotipo de Ig mediada por células B en ratones después de la inmunización de antígenos T dependientes y T independientes.

Caracterización de las respuestas de isotipo de inmunoglobulina dependiente del timo y timo-independiente en ratones usando el análisis enzima-ligado del inmunosorbente

Este artículo describe un método conveniente para monitorear los cambios dinámicos en los títulos de anticuerpos para dos isotipos de inmunoglobulina simultáneamente (ya sea IgA, IgM o IgG) como resultado de una respuesta inmune a la infección por SARS-CoV-2 o la vacunación. Este 'Panel de Respuesta Inmune Covid-19 Multianalito' emplea tres inmunoensayos indirectos construidos sobre microesferas codificadas que se leen utilizando un lector multiplex basado en flujo con capacidad de 'doble...

Monitoreo dinámico de la seroconversión mediante un ensayo de inmunodaxia multianalto para Covid-19

Este protocolo describe una metodología para la preparación de perlas de látex para ensayos con anticuerpos IgY para la detección de antígenos.

Estandarización de un ensayo citométrico de perlas basado en anticuerpos de yema de huevo

Los inmunoensayos basados en sangre total proporcionan una herramienta fácil y eficiente en recursos para analizar la inmunidad específica del antígeno con fines de diagnóstico e investigación. Este artículo proporciona un protocolo optimizado basado en sangre total con coestimulación dual para un análisis exhaustivo de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales, incluida una versión de bajo volumen para pacientes pediátricos y animales pequeños.

Ensayo de sangre total con coestimulación dual para el análisis específico de antígenos de la inmunidad del huésped a patógenos fúngicos y virales

Presentamos un ensayo ELISA sándwich validado utilizando nuevos anticuerpos monoclonales anti-HER2. Este ensayo permite la cuantificación precisa de la proteína HER2 unida a las células y liberada a partir de células cultivadas in vitro y otras muestras, incluidas la sangre y los tejidos.

Ensayo inmunoquímico validado para la determinación completa del receptor 2 del factor de crecimiento epidérmico humano liberado y unido a las células

Aprende la técnica de cell-free dot blot para inmunoensayo accesible y económico en sueros humanos y animales. Este método permite detectar respuestas de anticuerpos en entornos con recursos limitados.

Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales (Video) | JoVE Journal

Cell-free dot blot como plataforma de inmunoensayo práctica y adaptable para la detección de la respuesta de anticuerpos en sueros humanos y animales

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