Aislamiento, fijación y caracterización de leucocitos juveniles de dorada y riñón por citometría de flujo

Este protocolo estandariza el aislamiento, la fijación y la evaluación de la viabilidad de los leucocitos del riñón de la cabeza de dorada mediante citometría de flujo, lo que permite un procesamiento de muestras de alto rendimiento sin comprometer la calidad.

Las técnicas tradicionales como el recuento manual de células con cámaras de Neubauer y los frotis de sangre teñidos son comunes en la inmunología de peces. La citometría de flujo se está volviendo popular, pero su aplicación en estudios con peces sigue siendo limitada. Los métodos tradicionales de inmunología con peces son intensivos en el hígado y propensos a errores. Los estudios en animales juveniles están limitados por los desafíos para obtener leucocitos puros y la necesidad de una evaluación inmediata de la viabilidad, lo que restringe el rendimiento de la muestra.

Este protocolo permite un análisis detallado de las células inmunitarias mediante la identificación de poblaciones clave de leucocitos y la distinción de las células vivas de las muertas. La fijación conserva la viabilidad durante un mes, lo que permite flujos de trabajo de citometría de flujo escalables, flexibles y eficientes.

Nuestros hallazgos avanzan en la inmunología de los peces al revelar los mecanismos inmunológicos y los impactos ambientales en la viabilidad celular, lo que ayuda al desarrollo de estrategias mejoradas de manejo de enfermedades en la acuicultura.

[Narrador] Para comenzar, aclimate a los juveniles de dorada, Sparus aurata, en sistemas de acuicultura de recirculación donde el agua se filtra y recircula continuamente para mantener un ambiente estable. Asegúrese de que el sistema incluya filtración mecánica y biológica, aireación y control de temperatura para mantener parámetros abióticos óptimos. Ajuste los factores ambientales como el fotoperíodo, la temperatura, la salinidad, el pH y los niveles de oxígeno disuelto de acuerdo con las necesidades específicas del estudio. Use una red para transferir suavemente las doradas juveniles a un recipiente de retención temporal lleno de agua del tanque. Después de sacrificar al pescado, coloque un pez de lado en una bandeja de disección estéril. Con un bisturí, haga una incisión cuidadosa a lo largo de la línea media ventral del pez desde el respiradero hacia las branquias. Use tijeras de disección para extender la incisión y exponer los órganos internos. Ubique el riñón de la cabeza, que está situado justo detrás de las branquias cerca de la región dorsal anterior de la cavidad corporal y se extiende a lo largo de la parte superior debajo de la columna vertebral. Con un par de pinzas de punta fina y tijeras, limpie cuidadosamente los tejidos circundantes para visualizar mejor el riñón de la cabeza. Luego levante el riñón de la cabeza y haga cortes precisos a su alrededor para liberarlo de los tejidos circundantes. Coloque inmediatamente el riñón de la cabeza extirpado en un colador de células colocado dentro de una placa de Petri estéril. Pipetea dos mililitros de solución salina equilibrada de Hanks, o HBSS, en una placa de Petri estéril. Macerar el riñón de la cabeza extirpado en el colador celular usando el émbolo de una jeringa para liberar las células en la solución. A continuación, prepare una solución de medio de gradiente de densidad. Pipetee 600 microlitros de la solución de medio de gradiente de densidad en tubos de poliestireno de fondo redondo de cinco mililitros. Transfiera lentamente dos mililitros de suspensión celular de la placa de Petri a cada tubo. Centrifugar a 400g durante 45 minutos a cuatro grados centígrados con el freno apagado. Después de la centrifugación, retire el tubo y observe el anillo leucocitario. A continuación, utilice una pipeta Pasteur estéril para transferir suavemente aproximadamente 100 microlitros del anillo leucocitario a un tubo de microcentrífuga de dos mililitros. Ahora, aumente el volumen a dos mililitros con HBSS y vuelva a suspender suavemente las células. Centrifugar la muestra a 400g durante 10 minutos a cuatro grados centígrados. Después de la centrifugación, deseche con cuidado el sobrenadante sin alterar el gránulo en el fondo del tubo. Luego, vuelva a suspender el gránulo purificado en un mililitro de HBSS hasta que la concentración celular final esté entre 10,000 y un millón de células por mililitro. Agregue 50 microlitros de dimetilsulfóxido a un vial que contenga el tinte reactivo. Después de ajustar la densidad celular a un millón de células por mililitro, transfiera un mililitro de la suspensión celular a tubos de microcentrífuga de dos mililitros. Prepare muestras de control de viabilidad como se indica. Induzca la muerte celular en los tubos tres y cuatro colocándolos en un baño de agua a 70 grados centígrados durante siete minutos. Para teñir las células, pipetee un microlitro del colorante fluorescente reconstituido en tubos dos y cuatro que contengan un mililitro de suspensión celular y mezcle bien. Incube los tubos teñidos a temperatura ambiente durante 30 minutos, protegidos de la luz. A continuación, lave las células dos veces con un mililitro de HBSS y vuelva a suspender el gránulo final en 900 microlitros del mismo tampón. Luego pipetea 100 microlitros de formaldehído al 37% para fijar las células e incuba a temperatura ambiente durante 15 minutos. Después de lavar las células dos veces con un mililitro de HBSS que contiene BSA al 1%, vuelva a suspender en un mililitro de la misma solución. Guarde las muestras a cuatro grados centígrados en un refrigerador hasta por un mes. Coloque el tubo de muestra fijo en el puerto de muestra del citómetro de flujo para su análisis. Registre un mínimo de 10.000 eventos para cada muestra dentro de la puerta de singlets. Guarde todos los datos y haga una copia de seguridad en unidades externas o almacenamiento en la nube. Visualice los datos de citometría de flujo trazando el área de dispersión hacia adelante frente al área de dispersión lateral para evaluar el tamaño y la granularidad de las células. Realice la activación de celdas singlete y excluya los multiplets trazando el área de dispersión directa frente a la altura de dispersión directa. Identifique las tres poblaciones de leucocitos en función de los perfiles de dispersión directa versus lateral. Establezca el umbral para la tinción de colorante de viabilidad en el canal de fluorescencia correspondiente para distinguir las células vivas y muertas. En condiciones óptimas, los linfocitos, monocitos y granulocitos constituyeron el 31%, 38% y 31% de la población leucocitaria respectivamente, mientras que bajo estrés térmico, los linfocitos disminuyeron al 21,3%, los monocitos aumentaron al 45,6% y los granulocitos se mantuvieron estables al 33,1%. La muestra expuesta a condiciones óptimas mostró una mayor viabilidad, con un predominio de células vivas en todas las poblaciones de leucocitos. Por el contrario, la muestra con estrés térmico mostró un aumento significativo en la muerte celular.