Investigaciones multiescala del procesamiento cortical mediante la integración de politrodos laminares y optogenética con microelectrocorticografía en roedores

Cómo los laboratorios investigan cómo la actividad cerebral da lugar a funciones, como la percepción y la cognición, utilizando ECOG y otras herramientas para vincular la actividad neuronal local con señales corticales a una escala más amplia.

Las grabaciones de picos extracelulares en imágenes de dos fotones se utilizan para medir la actividad de la población, pero ECOG es una de las pocas técnicas disponibles tanto en humanos como para la investigación básica en animales.

La actividad cerebral abarca muchas escalas espaciales y temporales. Ningún método de señal los captura todos a la vez, pero ECOG tiene suficiente resolución temporal y espacial para muchas preguntas críticas.

Nuestro protocolo cierra una brecha clave al combinar ECOG con registros locales y optogenética, proporcionando información a microescala de manera efectiva a partir de las señales de la superficie cortical de mesoescala.

Nuestros hallazgos ampliarán el uso de ECOG como parte de paradigmas experimentales multimodales para estudiar los principios fundamentales de la organización neocortical y revelar biomarcadores de funciones corticales específicas en humanos.

[Instructor] Para comenzar, coloque un ratón anestesiado en una cama quirúrgica y use pinzas para levantar un punto en la piel sobre el cráneo. Luego, con unas tijeras quirúrgicas, reseque aproximadamente una porción de un centímetro de diámetro de la piel. Con un raspador, limpie el tejido conectivo y el periostio de la parte superior del cráneo. Enjuague la solución salina sobre el cráneo. A continuación, use un taladro quirúrgico a baja velocidad para perforar un orificio de rebaba en la parte frontal del hemisferio ipsilateral al área registrada. Perfora una zanja poco profunda en el perímetro para definir el contorno de la craneotomía. Cuando el cráneo se haya adelgazado hasta el punto en que una presión extremadamente ligera haga que toda la ventana se mueva visiblemente, retire la parte adelgazada. Aplique solución salina con regularidad y use una esponja hemostática para mantener el cerebro húmedo. Ahora, inserte el cable de referencia de plata aproximadamente un milímetro en el orificio de la fresa para que entre en contacto con la superficie del cerebro sin causar sangrado. Después de la implantación de la barra de cabeza, coloque al animal en la configuración de grabación. Ahora conecte la rejilla de microelectrocorticografía al cabezal utilizando los conectores de clip de fuerza de inserción cero. Sostenga la placa electrónica del cabezal en su lugar usando una barra mecánica fijada a un micromanipulador. Baje la rejilla de microelectrocorticografía horizontalmente para alinearla plana sobre la craneotomía a lo largo del eje anteroposterior. Una vez que la rejilla esté cerca del cerebro sin tocarla, conecte el cable de referencia de la rejilla al pin de oro de alambre plateado implantado. A continuación, baje aún más la rejilla para hacer contacto con el cerebro. Mueva la rejilla lateralmente para deslizarse sobre la superficie húmeda de la duramadre y continúe ajustándola hasta que esté centrada a lo largo del eje mediolateral. Use aspiración o una esponja quirúrgica alrededor de los bordes de la craneotomía para eliminar el exceso de solución salina. Una vez que la preparación esté un poco más seca, verifique que la rejilla se adhiera más firmemente a la duramadre y no se deslice. Aplique un movimiento lateral a medial a la rejilla para asegurar el contacto con los electrodos más laterales mientras el cable de la rejilla se dobla para coincidir con el contorno del cerebro. Observe la actividad electrofisiológica utilizando el software de registro. Bajo anestesia ligera, controle los patrones de señales cerebrales variables. Asegúrese de que los cables de red, de referencia y de tierra estén conectados correctamente para producir una alta relación señal-ruido. Utilice el software Trodes con filtrado de paso de banda entre 300 y 6.000 hercios para monitorear el ruido en el rango de alta frecuencia y asegurarse de que permanezca dentro de decenas de microvoltios. Evalúe la capacidad de respuesta sensorial generando estímulos de ruido, como aplausos o chasquidos de dedos, y observe los potenciales eléctricos de la superficie cortical correspondientes. Encienda la luz optogenética a baja intensidad para guiar la fuente de luz y ayudar a colocar la fibra, luego use el brazo articulado para colocar aproximadamente la luz optogenética hacia el área objetivo. Enfoque y ajuste la posición de la fibra con un micromanipulador o tornillos de ajuste fino antes de registrar las señales. Para limpiar la rejilla, si el cerebro está seco, aplique una pequeña gota de solución salina sobre la superficie del cerebro con una jeringa y déjela reposar durante 30 segundos a un minuto antes de levantar la rejilla. Trabajando bajo el microscopio, levante suavemente la rejilla de la superficie del cerebro con micromanipuladores. Se observó una respuesta electrocorticográfica localizada aproximadamente 10 milisegundos después de la estimulación de un solo bigote, con amplitudes de deflexión máxima de alrededor de un milivoltio. La respuesta más fuerte del electrodo fue evocada por la estimulación de su bigote correspondiente, mientras que se observó una respuesta más débil o nula de los bigotes más distantes. La inhibición optogenética condujo a una supresión de la respuesta cortical evocada por bigotes solo en animales que expresan opsinas inhibidoras. Los artefactos optoeléctricos aparecieron solo al inicio y al desplazamiento de la estimulación del pulso de luz de cinco segundos utilizando la fibra de gran diámetro. La fibra óptica de un milímetro produjo un gran artefacto de luz en la rejilla de microelectrocorticografía, mientras que la fibra de 200 micrómetros minimizó significativamente este artefacto. Las grabaciones de microelectrocorticografía en ratas mostraron fuertes respuestas evocadas auditivamente, con una respuesta máxima alrededor de 25 a 30 milisegundos después del estímulo. Se observaron picos de actividad gamma alta, gamma ultra alta y de unidades múltiples en el espectro de frecuencia de la respuesta evocada, con gamma alta como componente dominante. La microelectrocorticografía se registró junto con grabaciones de sondas laminares. Se detectaron formas de onda de pico claras en grabaciones de politrodos, que muestran formas de onda distintas a través de múltiples canales. Los gráficos de amplitud de respuesta de frecuencia de los electrodos de microelectrocorticografía de superficie coinciden estrechamente con los de los electrodos de politrodo laminar en profundidad, lo que demuestra una sintonización auditiva consistente. Un mapa tonotópico de alta resolución generado a partir de señales gamma altas reveló la organización funcional de los campos corticales auditivos, incluidas las áreas primaria, posterior y ventral.