Un protocolo de citometría de electroporación para microscopía de fluorescencia de células vivas utilizando el cultivo celular U2 OS

El alcance de esta investigación se centra en el efecto de los campos eléctricos pulsados en el comportamiento celular, particularmente cómo la electroporación afecta el ciclo celular.

La principal ventaja de este protocolo es la capacidad de realizar experimentos continuos de electroporación de células vivas utilizando cultivos de células de mamíferos durante un máximo de 72 horas. Nuestro laboratorio se centra en adaptar estas técnicas para la microfluídica, lo que permitirá tamaños de muestra más bajos, requisitos de reactivos reducidos y un mejor control de muestras para protocolos futuros.

[Narrador] Para comenzar, cultive células U2OS FUCCI CA5 en una placa de 10 centímetros con 10 mililitros de glucosa alta de DMEM que contenga 10% de FBS y 1% de penicilina estreptomicina. Incube la placa a 37 grados centígrados en un ambiente con un 5% de dióxido de carbono. Cuando el cultivo alcance el 80% de confluencia, aspire el medio de la placa. Lave las células con PBS, luego agregue un mililitro de tripsina al 0,25% e incube durante 1,5 minutos para disociar las células. Neutralizar la tripsina resuspendiendo las células disociadas en cinco mililitros de DMEM de alta glucosa. Obtenga una muestra de 100 microlitros del cultivo resuspendido y colóquela en el cubreobjetos de vidrio inferior dentro de la cámara del sistema de citometría de electroporación. Asegúrese de que la cámara tenga un 30% de confluente después de introducir la muestra. Agregue lentamente cuatro mililitros de glucosa alta de DMEM en el otro extremo de la cámara, evitando que el líquido elimine la muestra. Coloque un portaobjetos de microscopio estándar sobre la cámara e incube la cámara a 37 grados Celsius y dióxido de carbono al 5% durante 24 horas. Encienda el microscopio fluorescente invertido con una cámara de control ambiental para permitir que el sistema se estabilice antes de la electroporación. Mientras la cámara ambiental se estabiliza, use cables de pinza de cocodrilo para conectar un multímetro digital al condensador generador de pulsos y al interruptor de alto voltaje para una configuración rápida con la cámara de electroporación. Ahora, seleccione un aumento de 20x en el microscopio. En el software del microscopio, asegúrese de que se seleccionen los canales FITC/GFP y A594 Texas Red M Cherry correspondientes a las dos proteínas fluorescentes del sistema FUCCI CA5. Utilice ajustes de baja exposición, normalmente menos de 0,05 segundos, para evitar daños fotográficos durante las imágenes a largo plazo. Tome imágenes de prueba para optimizar el enfoque y la calidad de la imagen antes de iniciar la adquisición de imágenes de lapso de tiempo. Programe el lapso de tiempo para capturar imágenes de tres a seis puntos de vista diferentes cada 10 minutos durante un período de 24 horas para obtener un alto volumen de datos del ciclo celular por lapso de tiempo mientras mitiga el daño fotográfico. Asegúrese de que el enfoque automático esté habilitado para el canal A594 para optimizar el seguimiento de la cultura durante el lapso de tiempo. Deje el software abierto hasta que se complete la electroporación. Coloque la cámara de citometría de electroporación en el microscopio equipado con una cámara ambiental adecuada. Antes de la electroporación, mantenga la cámara cerrada y asegúrese de que el sistema ambiental permanezca funcionando para mantener las condiciones adecuadas del ciclo celular. Abra la cámara ambiental y conecte un multímetro digital al generador de pulsos, luego, con cables de pinza de cocodrilo, conecte el generador de pulsos a los electrodos de la cámara. Cargue el condensador del generador de pulsos a 180 voltios. Descargue el pulso en la cámara rápidamente hasta que el multímetro digital muestre cero voltios. Retire todas las conexiones eléctricas de la cámara y vuelva a colocar rápidamente la tapa de la cámara para garantizar condiciones óptimas de cultivo. Active la imagen de lapso de tiempo inmediatamente una vez que la cámara ambiental esté bien colocada. Una vez completado el lapso de tiempo, use el software del microscopio para guardar todas las imágenes capturadas como un solo video. Ajuste la calidad visual para mejorar la claridad de las características de la celda para la cuantificación manual. Finalmente, observe los cambios en las señales FITC y A594 a lo largo del tiempo para rastrear las fases celulares en el video de lapso de tiempo. Usando el sistema Fuji, los datos visuales se recopilaron mediante el seguimiento de los cambios de color relacionados con la expresión y ubiquitinación de proteínas, lo que permitió una clara distinción de las fases G1, S, G2, M. Esto permitió la observación directa de la progresión del ciclo celular en diferentes condiciones. Esta figura proporciona un resumen de los datos clave recopilados de dos conjuntos de experimentos utilizando cultivos celulares sincronizados y no sincronizados en fase S. La exposición al campo eléctrico pulsado en células no sincronizadas aumentó significativamente la duración promedio de las fases G1, G2 y M, mientras que la fase S permaneció sin cambios. En las células sincronizadas, la exposición al campo eléctrico pulsado condujo a una reducción de la duración de las fases G1, S y G2, aunque solo S y G2 fueron estadísticamente significativas, mientras que la fase M no se vio afectada.