Name: Preparación y mantenimiento del experimento de jaula IsoPositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-02-28T14:45:00.000+00:00
Duration: 7 min 45 s
Description: Aprende a preparar y mantener el sistema de jaulas IsoPositive para trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes. Este método permite establecer comunidades microbianas estables para investigar el papel de las bacterias en el cáncer.

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Los ratones libres de gérmenes son una herramienta esencial en el repertorio de los investigadores del microbioma, ya que permiten diseccionar la contribución de la microbiota en los estados de salud y enfermedad del huésped. Los ratones libres de gérmenes nacen completamente estériles y permanecen axénicos durante toda su vida1. La colonización de ratones libres de gérmenes con cepas bacterianas específicas permite estudios causales entre esos taxones y las funciones metabólicas, inmunitarias u otras funciones del huésped 2,3,4,5. Particularmente ventajosa es la capacidad de "humanizar" ratones libres de gérmenes a nivel de la microbiota mediante el trasplante de heces obtenidas de donantes humanos y, cuando se alojan en condiciones de barrera, evitan la contaminación por microorganismos derivados de la murino1. Este enfoque ha permitido muchos descubrimientos importantes en el campo del microbioma, por ejemplo, el efecto del microbioma intestinal humano en la respuesta a la inmunoterapia contra el cáncer 6,7,8.
Sin embargo, aunque los ratones humanizados libres de gérmenes son invaluables para los esfuerzos de investigación en el campo del microbioma, existen muchas limitaciones que han inhibido la adaptación más amplia de este enfoque. Los ratones libres de gérmenes se crían y mantienen en grandes aisladores semirrígidos o de película flexible, pero los experimentos funcionales requieren que se establezcan mini-aisladores separados, con un mini-aislador que alberga varias jaulas, pero solo bajo una condición experimental. Este enfoque de mini-aislador aumenta la huella espacial y el costo, al tiempo que limita severamente el número de condiciones experimentales que se pueden investigar en un experimento y el número de experimentos que se pueden ejecutar en paralelo. Una solución prometedora es el uso de un sistema de jaula individual y modular llamado sistema de bioexclusión ISOcage P (en adelante, sistema isocage)9,10. El sistema isocage permite la manipulación experimental de ratones libres de gérmenes en jaulas aisladas individuales, herméticamente selladas y con presión positiva, lo que permite condiciones experimentales separadas entre cada jaula en lugar de entre cada miniaislador. Con la técnica aséptica adecuada, los animales pueden ser alojados en isojaulas durante un máximo de 12 semanas en condiciones libres de gérmenes o humanizados mediante trasplante fecal humano para su uso en cualquier enfoque experimental compatible (es decir, puede realizarse en condiciones asépticas). Se pueden ejecutar múltiples experimentos independientes en paralelo utilizando el sistema isocage, y la huella de espacio y el costo son dramáticamente menores que la ejecución de múltiples experimentos en mini-aisladores.
El propósito de la cría de ratones libres de gérmenes en aisladores de reproducción de película flexible es preservar cuidadosamente el estado axénico11. Las técnicas utilizadas para monitorear el estado libre de gérmenes incluyen hisopos de rutina de superficies corporales y cavidades orales de ratones, así como la recolección aséptica de muestras fecales, que se cultivan y analizan mediante ensayos comerciales basados en PCR. Se requieren pruebas bacterianas, serológicas y fúngicas de estas muestras para determinarel estado libre de gérmenes. Cuando los ratones libres de gérmenes se transfieren de los aisladores de cría a las isojaulas para uso experimental, los ratones se frotan con muestras y se prueban para validar su estado libre de gérmenes en el momento de la transferencia. Los controles de esterilidad de Isocage se realizan mediante la recolección aséptica de muestras fecales, que luego se cultivan para la detección de contaminantes bacterianos, virales y fúngicos. Es necesario recopilar y registrar cuidadosamente los resultados de estos controles de esterilidad desde el nacimiento hasta el final de un protocolo experimental para validar el estado libre de gérmenes de estos ratones.
El sistema de isojaula está compuesto por jaulas individuales (Figura 1), discos de transferencia para el transporte fuera de los aisladores de cría (Figura 1) y el bastidor de isojaula, que alberga las jaulas (Figura 2). Cada isojaula contiene un filtro de aire de partículas de alta eficiencia (HEPA) a nivel de jaula instalado en la entrada de aire de suministro y una junta de silicona que hace un sello hermético cuando está cerrada, lo que garantiza que ningún contaminante pueda ingresar a la jaula a través del aire (Figura 1A). Esta tapa de jaula se puede utilizar como superficie de trabajo estéril cuando se coloca boca abajo dentro de un gabinete de bioseguridad esterilizado (Figura 1A). Una rejilla de alambre dentro de la jaula sostiene la botella de comida y agua (Figura 1B). Las pinzas esterilizadas en autoclave dentro de la jaula se utilizan para todas las manipulaciones que requieren contacto con las superficies interiores de la jaula. La jaula en sí tiene muescas para un tarjetero de jaula extraíble para identificar a los animales en el exterior y boquillas de entrada y exportación de aire que se acoplan al estante de isocage (Figura 1C-E). Las abrazaderas de cierre seguras y un bloqueo de lengüeta en la tapa sellan la jaula cuando está lista para ser reacoplada en el sistema de bastidores (Figura 1F). La ropa de cama sugerida es Alpha-dri, y también se recomienda una cabaña de enriquecimiento esterilizable en autoclave (Figura 1F). Los discos de transferencia se utilizan para mover ratones libres de gérmenes desde los aisladores de cría hasta las isojaulas y contienen una tapa de compartimento giratoria con una abertura triangular para permitir la manipulación de los animales (Figura 1G-H). Los discos vienen en tamaños pequeños (21,6 cm de diámetro) y grandes (28 cm de diámetro), ambos con una capacidad de ocho ratones. La cinta esterilizada en autoclave se utiliza para crear sellos herméticos en la circunferencia y los orificios de aire del disco, lo que se realiza antes del remojo con esterilizante y el transporte en una bolsa empapada en esterilizante (Figura 1I). El sistema de rack en sí tiene una pantalla para monitorear los sopladores de aire, el estado del filtro HEPA a nivel de rack y la energía de emergencia de la batería para el rack, que son todas características incluidas en el sistema (Figura 2A). Un manómetro Magnehelic adjunto muestra la presión positiva mantenida por el sistema de jaulas, y un indicador visual de acoplamiento automático muestra el estado de acoplamiento de las jaulas (la lengüeta amarilla hacia afuera significa que no hay jaula acoplada, o que la jaula no tuvo éxito) (Figura 2B-D). También es necesario para la manipulación de isojaulas un gabinete de bioseguridad certificado estándar.
El protocolo presentado aquí describe los métodos adecuados para la transferencia exitosa de ratones libres de gérmenes de los aisladores de cría en condiciones asépticas a las isojaulas mientras se mantiene el estado libre de gérmenes, la humanización de ratones libres de gérmenes con purín fecal de donantes humanos y la recolección de heces de ratones alojados en la isojaula para la confirmación del estado libre de gérmenes o la preservación de la viabilidad para estudios funcionales posteriores. En este ejemplo, los ratones libres de gérmenes se humanizan con muestras fecales agrupadas de sujetos humanos tratados con inmunoterapia para el cáncer de pulmón y se dicotomizan como respondedores o no respondedores a la terapia. En este caso, el fenotipo de la respuesta a la inmunoterapia se transfirió mediante la humanización de la microbiota intestinal a los ratones receptores, que luego pudieron ser inoculados con células tumorales y tratados con inmunoterapia. El protocolo de purín fecal humano se puede adaptar fácilmente a cualquier heces de donante humano o a cualquier modelo preclínico de enfermedad que el investigador desee. Con este protocolo, es posible transferir cualquier microbiota fecal humana de un donante al huésped libre de gérmenes, lo que permite seguir investigando el papel de la microbiota en la salud y la enfermedad.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig01.jpg"> 
Figura 1: Diagrama esquemático de la isojaula y los discos de transferencia. (A) Vista de arriba hacia abajo de la parte inferior de la tapa de la jaula, con etiquetas que indican la ubicación del filtro HEPA interno a nivel de la jaula y el sello de la junta de silicona. (B) Vista de arriba hacia abajo del interior de la jaula, con etiquetas que indican la tapa de la barra de alambre, la botella de agua interna y el pico, y la ubicación en el estante de alambre para contener comida esterilizable en autoclave. (C) Vista frontal de la jaula que muestra muescas para el tarjetero de la jaula. (D) Vista de arriba hacia abajo de una jaula completa con la tapa en la parte superior, que muestra cómo se instala el filtro HEPA en la boquilla de entrada de aire. (E). Vista trasera de la jaula que muestra las boquillas de entrada y exportación de aire que se acoplan al sistema de bastidor isocage. (F) Vista lateral de una jaula completa con la tapa en la parte superior, con etiquetas que indican las abrazaderas de cierre seguras en la posición abierta, con lengüetas blancas en cada abrazadera que las bloquean en su lugar. El interior de la jaula muestra ropa de cama Alpha-dri en capas en la parte inferior y una cabaña de enriquecimiento sugerida colocada en la ropa de cama. (G) Vista de arriba hacia abajo de los discos de transferencia con la tapa en la parte superior. (H) Vista superior hacia abajo del interior del disco de transferencia, que muestra la tapa del compartimento giratorio con una abertura triangular para permitir la manipulación de los animales. (I) Vista lateral del disco de transferencia completamente ensamblado que muestra la colocación de la cinta esterilizada en autoclave, lo que crea un sello hermético durante la transferencia del aislador de cría a la isojaula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68029/68029fig02.jpg"> 
Figura 2: Diagrama esquemático del sistema de estanterías isocage. (A) Estantería isojaula completa con jaulas acopladas y una etiqueta que indica la pantalla de monitoreo para el estado del soplador de aire, el estado del filtro HEPA y la batería de emergencia. En la parte inferior izquierda del bastidor se encuentra la ranura para el filtro HEPA a nivel de bastidor. (B) Manómetro Magnehelic adjunto que muestra la presión positiva mantenida por el bastidor. (C) Una isojaula acoplada sin indicador de acoplamiento amarillo visible, que demuestre una conexión exitosa entre el bastidor y las boquillas de aire. (D) Una ranura vacía en el bastidor, con un indicador visual de acoplamiento automático visible que indica que no hay ningún bastidor en su lugar y que no hay conexión de las boquillas de aire con una isojaula. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68029/68029fig02large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Jeringa de punta deslizante BD de 1 mL estéril, de un solo uso</td><td>Fisher Scientific</td><td>309659</td><td></td></tr><tr><td>Tubo con tapón de rosca de 2.0 mL, sin moleteado, con faldón, natural, tubo estéril E-Beam con tapa adjunta</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-755-228</td><td></td></tr><tr><td>36 x 32 x 48" 3 mil Bolsas de polietileno con fuelle</td><td>Uline</td><td>S-13455</td><td></td></tr><tr><td>Tanque de 5 galones de activador de esterilizante de cloro y dióxido de carbono Exspor&nbsp;</td><td>Ecolab</td><td>6301680</td><td></td></tr><tr><td>tanque de 5 galones de base de esterilizante de cloro y dióxido de carbono Exspor&nbsp;</td><td>Vasos</td> de precipitados de polipropileno <td>Ecolab 6301194</td><td></td></tr><tr><td>de 600 ml</td><td>Fisher Scientific</td><td>S01914</td><td></td></tr><tr><td>Ropa de cama ALPHA-dri</td><td>Papeles</td><td></td><td></td></tr> especiales de Shepherd <tr><td>Cámara anaeróbica</td><td>Coy Lab Products</td><td>Tipo B</td> Armario de bioseguridad clase 2 <td></td></tr><tr><td></td><td>Certificado Nuaire</td><td></td><td></td></tr><tr><td>IsoCage Filtro HEPA esterilizable en autoclave XT Extreme Temperature</td><td>Tecniplast</td><td>1245ISOFHXT</td><td></td></tr><tr><td>Lente Transparente LPX IQuity Gafas de Seguridad&nbsp;</td><td>Fastenal</td><td>922205455</td><td></td></tr><tr><td>DuPont&nbsp; Tyvek&nbsp; Funda - 18"</td><td>Uline</td><td>S-13893E</td><td></td></tr><tr><td>DWK Life Sciences DURAN 45 mm Tapón de caucho natural a presión</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-258-107</td><td>Tapón de goma para botellas autclave de 1 L</td></tr><tr><td>Botellas pulverizadoras Dynalon Quick Mist HDPE</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-438-12B</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran Cilindros graduados de polipropileno</td><td>Fisher Scientific</td><td>03-007-44</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbran&nbsp; Pinza de disección de punta roma</td><td>Fisher Scientific</td><td>08-887</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Bolsas de esterilización de sellado instantáneo</td><td>Fisher Scientific</td><td>01-812-51</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand Recta Ancha Punta fuerte Pinzas de aplicación general&nbsp;</td><td>Fisher Scientific</td><td>16-100-107</td><td></td></tr><tr><td>Fisherbrand&nbsp; Cinta de autoclave sin plomo</td><td>Fisher Scientific</td><td>15-901-110</td><td></td></tr><tr><td>Aguja sonda nasogástrica, acero inoxidable reutilizable. Recto. Aguja de calibre 22, diámetro de la punta 1,25 mm, longitud 38 mm o 1,5 pulgadas (doz)</td><td>Braintree Scientific</td><td>N-PK 020</td><td></td></tr><tr><td>H-B Instrument Durac Timer Fisher</td><td>Scientific</td><td>13-202-015</td><td></td></tr><tr><td>Jaulas y bastidores IsoPositive (es decir, isojaulas)</td><td>Tecniplast&nbsp; &nbsp;</td><td>ISO30P</td><td>30 jaulas (6 w x 5 h),</td></tr> nitrilo de un solo lado <tr><td>Guantes resistentes a los productos químicos talla S (7), M (8) o L (9) 18" de largo, 22 mil, Ansell</td><td>Grainger</td><td>4T426</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de examen de nitrilo, medianos, no estériles, sin polvo</td><td>MedSupply Partners</td><td>KG-1101M</td><td></td></tr><tr><td>Bayoneta Oliva / Magenta Gas & Cartuchos de vapor / Filtro de partículas 2Ct&nbsp;</td><td>&nbsp; 3M/Fastenal</td><td>50051138541878</td><td></td></tr><tr><td>Policarbonato RadDisk Mini para Ratones 8-75 x 4</td><td>Braintree Scientific</td><td>IRD-P M</td><td></td></tr><tr><td>Tapas Bouffant de Polipropileno - 24", Azul</td><td>Uline</td><td>S-10480BLU</td><td></td></tr><tr><td>Puritan Cary-Blair Medium, 5 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>22-029-646</td><td></td></tr><tr><td>S, M y L Arnés de cabeza de silicona azul de doble modo Respirador de media máscara&nbsp;</td><td>&nbsp; 3M/Fastenal</td><td>50051131370826</td><td></td></tr><tr><td>Guantes de látex estériles sin polvo de la serie SGPF, CT International, Grosor = 6,5 mm, Longitud = 30,5 cm (12), Tamaño del guante = 8,5, Color del guante = Blanco</td><td>Fisher Scientific</td><td>18-999-102F</td><td></td></tr><tr><td>Cubierta de zapato antideslizante</td><td>Uline</td><td>&nbsp; S-25639</td><td></td></tr><tr><td>Bata Quirúrgica, Toalla, Estéril, Grande, 32/cs</td><td>Thomas Scientific</td><td>KIM 95111</td><td></td></tr><tr><td>Teklad Global Dieta para roedores extruidos con 18% de proteína (esterilizable)&nbsp;</td><td>Inotiv</td><td>2018SX</td><td></td></tr><tr><td>Thermo Scientific Nalgene Tanque de LLDPE rectangular de alta resistencia con tapa (volumen de 20 L)</td><td>Thermo Scientific</td><td>14-831-330J</td><td></td></tr><tr><td>VERIFY Indicadores biológicos autónomos de doble especie</td><td>Steris Healthcare</td><td>S3061</td><td></td></tr><tr><td>WypAll L40 1&frasl; Limpiaparabrisas de 4 pliegues</td><td>Uline</td><td>S-8490</td><td></td></tr></tbody></table>

preparación y mantenimiento del experimento de jaula isopositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes

Preparation and Maintenance of Bioexclusion IsoPositive Cage Experiment for Human Fecal Transplantation into Germ-Free Mice

Las muestras fecales humanas, agrupadas por el fenotipo respondedor y no respondedor de ICI (descrito previamente en el protocolo), se colocaron en ratones GF-WT de género mixto alojados en 3 isojaulas por grupo (n = 1-2 ratones/jaula, n = 6 para el respondedor y n = 5 para el no respondedor). A los ratones se les permitió aclimatarse durante 1 semana después de la transferencia. A continuación, se recogieron muestras fecales de estos ratones (en condiciones libres de gérmenes). A continuación, los ratones fueron atacado...

Preparación y mantenimiento del experimento de jaula IsoPositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes

Germ-free mice are an important investigation tool for understanding the contribution of microorganisms in host health and disease, enabling assessment of ...

preparation-maintenance-bioexclusion-isopositive-cage-experiment-for

Research

Investigación

JoVE Journal

Immunology and Infection

Inmunología e Infección

Este video demuestra el método para generar un ratón BLT (médula, hígado y timo) óseo doble humanizado con un sistema inmunológico humano funcional y un microbioma intestinal estable injertado similar al humano.

Generación de un modelo de ratón BLT (médula ósea, hígado, timo) doblemente humanizado

Este vídeo muestra un procedimiento de trasplante de microbiota fecal en un ratón con deficiencia de interleucina-10 e inflamación del colon. Los microbios fecales colonizados en el intestino liberan metabolitos secundarios, lo que provoca la liberación de citocinas antiinflamatorias y reduce la inflamación del colon.

Evaluación de los efectos del trasplante de microbiota fecal en un ratón con deficiencia de interleucina-10

Existe un creciente interés en la caracterización cuantitativa de los linfocitos intestinales debido al creciente reconocimiento de que estas células desempeñan un papel crítico en una variedad de enfermedades intestinales y sistémicas. En este protocolo, describimos cómo aislar poblaciones de células individuales de diferentes compartimentos del intestino delgado para su posterior caracterización por citometría de flujo.

El aislamiento y la citometría de flujo Caracterización de murino Small intestinal linfocitos

Describimos un método novedoso para generar ratones BLT dobles humanizados que cuentan con un sistema inmune humano funcional y un microbioma intestinal estable injertado similar al humano. Este protocolo se puede seguir sin necesidad de ratones libres de gérmenes o instalaciones gnotobióticas.

Un modelo de dos colores BLT humanizados con un microbioma intestinal humano estable y un sistema inmune humano

La interacción de la susceptibilidad genética, la inmunidad de la mucosa y el entorno microecológico intestinal está involucrada en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria intestinal (EII). En este estudio, aplicamos el trasplante de microbiota fecal a ratones deficientes en IL-10 e investigamos su impacto en la inflamación del colon y la función cardíaca.

Evaluación terapéutica del trasplante de microbiota fecal en un modelo de ratón deficiente en interleucina 10

El objetivo aquí es delinear un protocolo para investigar los mecanismos de la disbiosis en la enfermedad cardiovascular. Este documento discute cómo recolectar y trasplantar asépticamente muestras fecales murinas, aislar intestinos y usar el método "Swiss-roll", seguido de técnicas de inmunotinción para interrogar los cambios en el tracto gastrointestinal.

Aislamiento fecal murino y trasplante de microbiota

Aquí, describimos la estructura y los procedimientos operativos, incluidas las medidas de contención microbiana de una instalación para "ratones salvajes" utilizando como ejemplo la toma de muestras de sangre para el inmunofenotipado.

Procedimientos de Operación y Biocontención de una Instalación para Ratones de Laboratorio con un Microbioma Natural: Procedimiento de Inmunofenotipado

Este protocolo detalla el ensamblaje de matrices de mini-biorreactores que se utilizarán para el cultivo de flujo continuo de comunidades fecales complejas en condiciones anaeróbicas. También discutimos los métodos de ensamblaje, inoculación y muestreo de los reactores para su posterior análisis.

Conjunto de biorreactor para el cultivo continuo de comunidades fecales complejas

Este protocolo describe los pasos necesarios para la colonización de ratones con pks+ Escherichia coli en condiciones no inflamatorias, así como métodos no invasivos para la validación de la colonización y evaluación de la expansión de pks+ E. coli en heces.

Colonización con pks+ Escherichia coli de Murina en condiciones no inflamatorias

Lyme estudios de investigación de la enfermedad a menudo requieren la generación de garrapatas infectadas con el patógeno Borrelia burgdorferi, un proceso que suele tardar varias semanas. Aquí se demuestra un procedimiento tick microinyección basado en una infección que se puede lograr en cuestión de horas. También demostramos un método de inmunofluorescencia para la localización in situ de B. burgdorferi en garrapatas.

Métodos para la transferencia rápida y localización de la enfermedad de Lyme patógenos en el intestino garrapatas

Aprende a preparar y mantener el sistema de jaulas IsoPositive para trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes. Este método permite establecer comunidades microbianas estables para investigar el papel de las bacterias en el cáncer.

Preparación y mantenimiento del experimento de jaula IsoPositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes (Video) | JoVE Journal

Preparación y mantenimiento del experimento de jaula IsoPositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes

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