Preparación y mantenimiento del experimento de jaula IsoPositive de bioexclusión para el trasplante fecal humano en ratones libres de gérmenes

Estudiamos la interacción entre las bacterias y el huésped, y nuestro factor interno y externo modificó esta relación para cambiar la salud. Específicamente, estamos interesados en comprender el papel de las bacterias en el desarrollo, la progresión y la terapéutica del cáncer. Nosotros y otros laboratorios de microbioma utilizamos el sistema de jaula ISO positivo para transferir la comunidad fecal del sujeto humano a un huésped murino receptor para crear una comunidad microbiana estable y a largo plazo.

Esta tecnología nos ha permitido generar un nuevo descubrimiento sobre el papel de las bacterias clínicas relevantes en la salud y la enfermedad. Muchos ensayos clínicos prospectivos han encontrado asociaciones entre microbios específicos y el desarrollo, la progresión y la respuesta al tratamiento del cáncer, pero la correlación no implica causalidad. La humanización de ratones libres de gérmenes con muestras fecales humanas permite validar la relación causal en modelos de cáncer relevantes.

Utilizando el sistema de jaula positiva ISO, hemos demostrado que cepas específicas de bacteroides de pacientes con cáncer de pulmón de células no pequeñas que responden a la inmunoterapia humana confieren una respuesta a los ratones portadores de tumores de pulmón ortotópicos. Para comenzar, coloque 10 toallitas en el tanque de inmersión del esterilizante de dióxido de cloro y asegúrese de que estén completamente enjabonadas. Luego, usando un cilindro graduado, llene una bolsa de plástico grande con al menos 100 mililitros de esterilizante de dióxido de cloro.

Agite la bolsa para asegurarse de que todas las superficies interiores estén empapadas y colóquela a un lado. Retire una sola jaula ISO del bastidor y colóquela en el tanque de inmersión del esterilizante de dióxido de cloro, asegurando el contacto total con el líquido. Use toallitas húmedas para frotar todas las superficies de la jaula.

Después de remojar la jaula, pídele a un asistente que abra la bolsa de plástico empapada. Coloque la jaula dentro e inmediatamente cierre la abertura. Con una botella rociadora, rocíe la abertura de la bolsa con esterilizante de dióxido de cloro.

Una vez que todas las jaulas y suministros estén embolsados, sumerja los guantes resistentes a los productos químicos en un esterilizante de dióxido de cloro. Mientras tanto, mueva las toallitas empapadas al gabinete de bioseguridad y remoje todas las superficies. En el caso de las superficies no protegidas, exprima las toallitas sobre ellas sin tocarlas.

Después de 20 minutos, usando guantes esterilizados resistentes a productos químicos, mueva cada jaula y biberón al gabinete de bioseguridad esterilizado. Para abrir la jaula ISO herméticamente sellada, levante las lengüetas blancas de las dos abrazaderas a los lados de la tapa y tire de cada abrazadera hacia los lados para desbloquear la tapa. Usando las pinzas estériles dentro de la jaula en la parte superior de la rejilla de alambre, retire la botella de agua vacía y colóquela en el interior de la tapa.

Retire el sello de goma y vierta agua en la botella para llenarla. Con pinzas estériles, coloque la boquilla en la botella de agua y presione firmemente para sellar. Luego, con pinzas estériles, levante la rejilla de alambre y deslícela hacia atrás varias pulgadas para crear una abertura en el fondo de la jaula.

Apoye las pinzas estériles en la rejilla de alambre, asegurándose de que los mangos no entren en contacto con las superficies de la jaula. Al recibir el disco de transferencia, haga que el asistente sostenga y desenvuelva parcialmente la cubierta de plástico para que la superficie empapada quede expuesta pero no se toque. Con guantes resistentes a productos químicos empapados en esterilizante de dióxido de cloro, retire el disco de transferencia de la envoltura de plástico y colóquelo sobre una superficie plana dentro del gabinete de bioseguridad esterilizado.

Para abrir el disco de transferencia, despegue la cinta que sella la circunferencia del disco y luego retire la tapa. A continuación, utilizando las pinzas estériles previamente apoyadas sobre la rejilla, manipule la tapa del compartimento para alinear la abertura con el ratón que se va a transferir. Empleando pinzas estériles, agarre la base de la cola del ratón a través de la abertura de la cubierta del disco de transferencia, levante y transfiera el ratón a la jaula ISO a través de la abertura entre la rejilla de alambre y la jaula.

Una vez que se hayan transferido todos los ratones, reemplace la rejilla de alambre con las pinzas estériles. Levante la tapa de la jaula y vuelva a colocarla encima de la jaula. Levante cada abrazadera de la tapa de la jaula y bájela con cuidado sobre los lados de la jaula.

Empuje hacia abajo las lengüetas blancas para sellar de forma segura la tapa de la jaula. Ahora, haga que el asistente rocíe cada boquilla del sitio de acoplamiento en el estante de la jaula con esterilizante de dióxido de cloro. Retire la jaula del gabinete de bioseguridad y acompáñela en el estante de la jaula.

Amanece una nueva bata quirúrgica estéril y guantes quirúrgicos estériles en lugar de los guantes resistentes a los productos químicos. Para preparar las agujas de sonda nasogástrica, desenvuelva cada bolsa de esterilización y utilice el interior de la bolsa como una superficie de descanso seca y estéril. Conecte la aguja de sonda nasogástrica a la jeringa.

Abra el tubo de suspensión fecal y extraiga 200 microlitros de la suspensión en cada jeringa. Con pinzas, agarre la base de la cola del ratón y colóquela en la rejilla de alambre. Sujete suavemente al ratón raspando la piel suelta detrás del cuello.

Mientras sostiene el ratón en posición vertical vertical, inserte la aguja de sonda nasogástrica e inyecte suavemente la suspensión fecal. Retire inmediatamente la aguja después de la inyección. Coloque el ratón directamente en una de las tazas esterilizadas para su observación.

Después de que todos los ratones hayan recibido la sonda nasogástrica, use fórceps para mover a cada ratón de regreso a la cama de la jaula. La estructura de la comunidad fecal humanizada de ratón fue significativamente diferente entre los fenotipos de respuesta en los tres puntos temporales. Las heces de los ratones colonizados no mostraron diferencias en la estructura de la comunidad microbiana entre las semanas uno y dos, y las semanas dos y cuatro.

Mientras que las heces colonizadas por los ratones no respondedores mostraron una estructura de comunidad microbiana diferente entre las semanas uno y dos, pero una estructura similar entre las semanas dos y cuatro. Los inóculos de donantes humanos mostraron una mayor representación de Blautia, Eubacterium, ruminococcus y streptococcus, mientras que los ratones receptores tuvieron una mayor abundancia relativa de bacteroides, Lachnoclostridium, Marvinbryantia y Parabecteroides.