Regulación quimiogenética en células precursoras derivadas de células madre reprogramadas en el tratamiento de enfermedades neurodegenerativas

Nuestra investigación se centra en ilustrar el mecanismo patogénico subyacente a la enfermedad neurodegenerativa, al tiempo que integra tecnologías avanzadas para desarrollar técnicas de terapia celular efectivas para aplicaciones clínicas. Nuestro trabajo reciente trasplantó células madre modificadas quimiogenéticamente en modelos de ratón con enfermedad de Parkinson. Modulamos las actividades neuronales de una célula con fármacos de diseño, por lo que la monitorización electrofisiológica y la evaluación del comportamiento. Utilizamos principalmente CRISPR para ingeniería genética, electrofisiología para monitorear la actividad neuronal y ensayo de comportamiento para evaluar la recuperación de la función en modelos de enfermedad de Parkinson. La eficiencia de las células de injerto aumenta con la indicación, la supervivencia y la contribución funcional adecuadas al tejido huésped en la terapia basada en células madre, tratando enfermedades neurodegenerativas. Actividad celular descontrolada relacionada con consecuencias negativas, incluida la génesis tumoral.

Aprovechar la tecnología en las células madre humanas reprogramadas y las neuronas conductoras proporciona los medios para controlar con precisión las actividades neuronales mediante la administración del fármaco de diseño CNO.

[Instructor] Para comenzar, mezcle suavemente de 50 a 100 nanogramos del vector linealizado, fragmento uno y fragmento dos, en una proporción de uno a tres a tres molares, junto con una mezcla de clonación 2X. Incube la mezcla a 55 grados Celsius durante una hora para facilitar la recombinación homóloga utilizando el ensamblaje de Gibson. Inserte el ARN guía dirigido al sitio AAVS1 en el sitio BBS1 del vector PX458. Mantener las células madre reprogramadas en medios de cultivo, con el objetivo de una densidad celular de entre dos y 5 millones de células por mililitro. Ahora, mezcle de dos a 5 millones de células, dos microgramos de cada plásmido donante y dos microgramos de plásmido GRNA en 100 microlitros de tampón de electroporación. Transfiera la mezcla de células y plásmidos a una cubeta para realizar la electroporación. A continuación, transfiera las celdas electroporadas a placas de seis pocillos que han sido recubiertas con poli-D-lisina y laminina. Distribuya aproximadamente 500.000 células por pocillo en dos mililitros de medio de cultivo. Después de 72 horas de electroporación, use un citómetro de flujo para clasificar las células fluorescentes positivas. Configure el clasificador con el canal FITC para la detección de ZsGreen. Incluir células madre neurales inducidas no tratadas como controles negativos para definir la fluorescencia basal. Coloque las células individuales positivas para ZsGreen en placas de 96 pocillos prerecubiertas con poli-D-lisina y laminina y agregue 200 microlitros de medio de cultivo por pocillo. Mantenga el cultivo durante siete a 14 días. Aísle clones individuales que exhiban fluorescencia utilizando un microscopio de fluorescencia invertido equipado con un conjunto de filtros de proteínas fluorescentes verdes. Después de expandir las células positivas en placas recubiertas de 48 pocillos, divídalas en dos partes, una para el cultivo continuo y la otra para el genotipado. Extraer ADN genómico de los clones candidatos. Prepare la mezcla de PCR utilizando dos reparaciones principales, una para confirmar la inserción del gen de interés y otra para distinguir entre clones homocigotos y heterocigotos. Digestión de las células, lávalas en PBS y centrifuga a 250 G durante tres minutos. Realizar inyecciones estereotáxicas unilaterales de tres microlitros de 6-hidroxidopamina a una concentración de cinco microgramos por microlitro en el animal anestesiado. Apunte al cuerpo estriado derecho utilizando las coordenadas correctas. Administre una inyección intraperitoneal de apomorfina a un miligramo por kilogramo utilizando una solución de 0,5 miligramos por mililitro disuelta en solución salina cuatro semanas después de la cirugía para validar las lesiones. Administre una inyección estereotáxica de cuatro microlitros de la suspensión celular preparada en el modelo de ratón con enfermedad de Parkinson. Realice la prueba del cilindro en múltiples puntos de tiempo después del trasplante de células. Coloque un vaso de precipitados de vidrio con 20 centímetros de diámetro y 30 centímetros de altura sobre una superficie plana y no reflectante. Luego, coloque una cámara de vista superior sobre el cilindro para capturar el diámetro completo. Coloque cada mouse en el centro del cilindro e inicie la grabación de video simultánea durante tres minutos por sesión. Después de la sesión, devuelva el ratón a su jaula de origen. Evalúe el movimiento de las extremidades superiores de los ratones durante la sesión de tres minutos. Calcule el número de contactos de pared realizados por la extremidad anterior afectada en relación con el total de contactos realizados por ambas extremidades anteriores. Administre solución salina o N-óxido de clozapina a una dosis de 1,2 miligramos por kilogramo mediante inyección intraperitoneal. Realice la prueba del cilindro nuevamente para evaluar la modulación del comportamiento en el modelo de ratón con enfermedad de Parkinson después de la administración de N-óxido de clozapina. Después de extraer el cerebro del animal anestesiado e inmediatamente colocarlo en líquido cefalorraquídeo artificial a base de sacarosa helada para preservar la integridad celular Usando un vibratomo, corte el cerebro en secciones de 300 a 400 micrómetros de grosor. Ajuste la configuración de entrada de gas para equilibrarlo con 95% de oxígeno y 5% de dióxido de carbono a 34 grados Celsius. Transfiera los cortes de cerebro a una cámara llena de líquido cefalorraquídeo artificial. Cargue las pipetas de vidrio con solución intracelular helada, asegurando que la resistencia de los electrodos esté entre siete y 10 megaohmios. Monte cortes en una cámara de registro sumergida sobrefundida a dos mililitros por minuto con líquido cefalorraquídeo artificial oxigenado a 34 grados Celsius. Coloque las pipetas utilizando micromanipuladores motorizados bajo microscopía de contraste de interferencia diferencial infrarroja. Establezca la configuración de toda la célula mediante succión suave para parchear neuronas con resistencia superior a un gigaohm. Sujete las células a menos 70 milivoltios con un amplificador de pinza de parche y adquiera corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas de referencia durante ocho minutos a una frecuencia de muestreo de 10 kilohercios. Agregue 50 N-óxido de clozapina micromolar a la cámara de registro inmediatamente después de la medición inicial. Continúe registrando datos durante 16 minutos y controle los cambios en la frecuencia o amplitud de la corriente postsináptica excitatoria espontánea. Finalmente, realice un procedimiento de lavado reemplazando la solución de N-óxido de clozapina con líquido cefalorraquídeo artificial fresco y continúe registrando para evaluar la recuperación de la actividad sináptica. La modulación hemogenética con N-óxido de clozapina redujo el movimiento contralateral de las extremidades anteriores en ratones trasplantados con hM4D y lo aumentó en ratones trasplantados con hM3Dq en comparación con el tratamiento con solución salina, lo que demuestra un control conductual bidireccional. Los registros electrofisiológicos revelaron que las células trasplantadas con hM4D tenían intervalos más largos y amplitudes máximas más pequeñas en corrientes postsinápticas excitatorias espontáneas, mientras que las células trasplantadas con hM3Dq tenían intervalos más cortos y amplitudes más grandes, lo que indica la supresión y mejora respectivas de la actividad sináptica. El análisis de inmunofluorescencia confirmó la expresión in vivo de tirosina hidroxilasa y ZsGreen en las células hM4Di y hM3Dq trasplantadas, lo que respalda la integración exitosa del injerto.