Conjunto de biorreactor para el cultivo continuo de comunidades fecales complejas

Estudiamos las interacciones de las bacterias huésped y cómo los factores intrínsecos y extrínsecos influyen en la salud, centrándonos en los efectos bacterianos en el desarrollo, la progresión y la respuesta al tratamiento del cáncer. Estudiamos los inhibidores de puntos de control inmunitarios anti-PD-1 en comunidades bacterianas, encontrando que los metabolitos bacterianos mejoran la eficacia de la terapia anti-PD-1.

Aislar el impacto de los factores del huésped en el microbioma in vivo es un desafío debido a múltiples influencias. El conjunto de microbiorreactores permite un examen controlado de procesos específicos, aclarando sus efectos directos sobre las comunidades microbianas. Este protocolo ofrece un método rentable para cultivar comunidades fecales en condiciones controladas, al tiempo que permite a los investigadores realizar experimentos en paralelo con relativa rapidez.

[Instructor] Para comenzar, obtenga una matriz de reactores de seis pocillos impresa en 3D. Corte doce tiras de 25 milímetros de un tubo de PTFE de 1/8 de pulgada y use una navaja de afeitar para afeitar los extremos. Inserte un extremo de cada tira en la abertura de rosca de tornillo de un Luer macho con un accesorio de rosca 25 a 28. Atornille firmemente los accesorios en las aberturas designadas para desechos y muestras de la matriz. Ahora, inserte una barra de microagitación en cada pozo del reactor. Atornille un accesorio de rosca macho 1/4-28 en los orificios de origen de cada pozo del reactor. Atornille los accesorios adaptadores de barra de manguera Luer hembra en los accesorios roscados para las conexiones de desechos y fuentes de cada pozo del reactor. Luego, atornille la hembra Luer X a los accesorios adaptadores de lengüeta de manguera de 3-32 / 2 pulgadas en los accesorios de rosca de 1 / 4-28 para los puertos de muestra. Coloque un tabique de goma sobre los adaptadores de lengüeta de la manguera y doble la parte superior. A continuación, corte dos juegos de tubos E-LFL de 2,06 milímetros para las líneas de residuos y fuentes. Use agua caliente para ablandar el tubo para facilitar la fijación. Conecte el tubo a los accesorios adaptadores de lengüeta de manguera Luer X hembra de 1/8 de pulgada para las conexiones de fuente y desecho. Ahora fije un Luer macho con un anillo de bloqueo X a un adaptador de lengüeta de manguera de 1/8 de pulgada que se ajuste al otro extremo de la tubería. Atornille un adaptador de lengüeta de manguera Luer X hembra a 1/16 de pulgada que encaje en él. Conecte el tubo de dos topes del tamaño adecuado a las conexiones de fuente y desagüe correspondientes. Luego fije otro adaptador de lengüeta de manguera Luer X hembra a 1/16 de pulgada que se ajuste al otro extremo de la tubería. Después de repetir esto para todos los accesorios de origen y desecho, inserte un Luer macho con anillo de bloqueo X a accesorios adaptadores de lengüeta de manguera de 1/8 de pulgada a un trozo de tubo E-LFL 2. Conecte un extremo al adaptador de lengüeta de manguera Luer X hembra desocupado a 1/16 de pulgada al final de cada sección de tubería de dos paradas para todas las piezas. Después de repetir esto para todos los accesorios de fuente y desecho, conecte el tubo E-LFL de 2,06 milímetros para las líneas de fuente de los pozos uno y dos del reactor, utilizando los extremos opuestos de un Luer T hembra. Luego fije una pieza de tubo de cinco centímetros con Luer macho con anillo de bloqueo X a accesorios adaptadores de 1/8 de pulgada en cada extremo a la salida central de la T, lo que lleva a una segunda unión en T. Ahora conecte la tubería fuente E-LFL de 2,06 milímetros para el tercer reactor al lado opuesto de la segunda T. Conecte otro segmento de tubería de cinco centímetros que tenga un adaptador Luer macho con anillo de bloqueo X a 1/8 de pulgada en un extremo y un Luer hembra con anillo de bloqueo X a adaptador de 1/8 de pulgada en el otro. A continuación, conecte un Luer macho con anillo de bloqueo X a un adaptador de lengüeta de manguera de 1/8 de pulgada en un extremo de una pieza de 25 centímetros de tubo E-LFL de 2,06 milímetros. Fije un adaptador de lengüeta de manguera Luer X hembra a 1/8 de pulgada que se ajuste al otro extremo y cúbralo con papel de aluminio. Para ensamblar la botella de recolección de desechos, asegure sin apretar una tapa de dos orificios en una botella de dos litros. Inserte accesorios de rosca macho 1/4-28 en ambos orificios de la tapa. Luego conecte un Luer hembra con un adaptador de lengüeta de manguera de 1/8 de pulgada al accesorio de rosca macho que no se conecta al tubo de PTFE preconectado en la tapa. Conecte una pieza de cinco centímetros de tubo E-LFL de 2,06 milímetros al adaptador de lengüeta de manguera de la botella. Conecte un Luer macho con anillo de bloqueo X a un adaptador de lengüeta de manguera de 1/8 de pulgada al otro extremo del tubo antes de cubrirlo con papel de aluminio. Finalmente, cubra toda la tapa de la botella con papel de aluminio antes de esterilizar en autoclave a 121 grados Celsius y 15 psi durante 45 minutos. Una vez finalizado el autoclave, apriete los accesorios y los sellos de aluminio y coloque los reactores en una cámara anaeróbica durante 48 horas antes de su uso. Alinee la matriz del reactor dentro de la cámara anaeróbica sobre una placa de agitación magnética ajustada a 1,600 RPM. A continuación, coloque el tubo de dos topes para las líneas de origen y de residuos en las abrazaderas de las bombas peristálticas correspondientes. Bloquee las abrazaderas en su lugar si esto se hace menos de 25 horas antes de su uso. De lo contrario, déjelo suelto para reducir el desgaste de la tubería. Ahora retire la tapa de aluminio de la botella fuente. Atornille los accesorios en el Luer macho a los accesorios de rosca de 1/4-28, asegurándose de que estas aberturas estén conectadas a la tubería interna de PTFE. Retire las tapas de aluminio y conecte un filtro de jeringa de 0,22 micrómetros a la línea de ventilación de cinco centímetros tanto de la botella fuente como de la botella de desechos. Comience el flujo a una velocidad moderada para comenzar a llenar el reactor. Asegúrese de que la tubería de la cintura dentro de cada pozo del reactor esté colocada más abajo que la tubería de origen para evitar el sobrellenado o el vaciado completo de cada pozo. A medida que los reactores comiencen a llenarse, verifique que todos los pozos alcancen el mismo volumen y que el medio fluya hacia la cintura antes de dejar que los reactores se desgasifiquen durante la noche. Comience transfiriendo los materiales experimentales a la cámara anaeróbica durante 24 horas. Después de calcular la cantidad de inóculo fecal necesaria, transfiera las muestras fecales conservadas en viales criogénicos a la cámara anaeróbica y déjelas descongelar durante 15 minutos. Con una punta de pipeta de gran diámetro, transfiera el material fecal de los viales criogénicos a un tubo cónico de 50 mililitros. Centrifugar el tubo sellado a 200 g durante cinco minutos para sedimentar las partículas. Transfiera los tubos nuevamente a la cámara anaeróbica. Luego retire el sobrenadante. Use una espátula de laboratorio de autoclave para transferir los 5,7 gramos de sólidos fecales a un nuevo tubo cónico de 50 mililitros. Agregue 17,1 mililitros de solución salina estéril anaeróbica al tubo y ciérrelo herméticamente. Ahora agite el tubo durante cinco minutos antes de centrifugar como se demostró anteriormente. Use una toallita de laboratorio con lejía al 10% para esterilizar los septos en la parte superior de cada reactor durante al menos dos minutos. Después de devolver las muestras a la cámara anaeróbica, pipetee el sobrenadante a nuevos tubos cónicos de 50 mililitros. Ahora transfiera 3.8 mililitros de sobrenadante de lechada fecal en seis jeringas separadas de cinco mililitros equipadas con agujas de calibre 16 de 1.5 pulgadas. Retire la toallita con lejía de los septos del reactor. Luego inserte la aguja a través del tabique e inyecte lentamente 3.8 mililitros de lechada fecal en cada reactor antes de dejar reposar los reactores durante la noche. Después de una incubación de 16 a 18 horas, inicie el flujo hacia el reactor. Ajuste la placa de agitación magnética a la velocidad máxima inmediatamente después de inyectar la suspensión fecal. La composición de la comunidad microbiana en ambos reactores replicados cambió con el tiempo con diferentes especies que muestran una abundancia relativa variable a lo largo de los días. Las bacterias anaeróbicas fastidiosas, como los géneros Clostridium, se detectaron consistentemente en cada reactor en todos los puntos de tiempo.