Name: Imágenes de transferencia de energía por resonancia de Förster de células vivas de la dinámica de activación de Akt regulada metabólicamente en células HepG2 (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-23T13:50:00.000+00:00
Duration: 8 min 3 s
Description: Aprende a cuantificar la dinámica espaciotemporal de la activación de Akt en células HepG2 mediante imágenes FRET. Este protocolo permite estudiar la señalización de insulina y la regulación metabólica en cáncer.

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<table><tbody><tr><td>0,25% tripsina-EDTA</td><td>Gibco</td><td>Categoría#25200-056</td><td>Use PBS helado para el lavado de celdas</td></tr><tr><td>Plato de cultivo celular con fondo de vidrio de 15 mm</td><td>NIDO</td><td>Gato#801001</td><td></td></tr><tr><td>2&nbsp; Viales criogénicos Nalgene mL</td><td>Thermo Scientific</td><td>Categoría#5012-0020</td><td></td></tr><tr><td>5 ml de pipetas serológicas Stripette</td><td>Corning</td><td>Categoría#4487</td><td></td></tr><tr><td>95% de etanol</td><td>Kermel</td><td>Gato#C028005</td><td></td></tr><tr><td>Microscopio confocal A1 HD25/A1R HD25</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td>Aumento: 40 veces, Apertura numérica (NA): 1.30, Tiempo de permanencia de píxeles: 2.4 ms, Tamaño de píxel: 1024</td></tr><tr><td>Ampicilina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Categoría#A9393</td><td></td></tr><tr><td>Albúmina sérica bovina (BSA)</td><td>VWR Ciencias de la vida</td><td>Gato#N208-10g</td><td></td></tr><tr><td>Corning 25&nbsp; Matraces de cultivo rectangulares CM2</td><td>Corning</td><td>Gato#430639</td><td></td></tr><tr><td>Contador de celdas automatizado Countess 3</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#AMQAX2000</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de la cámara de recuento de células Countess</td><td>Thermo Scientific</td><td>http://www.thermofisher.com/#C10228</td><td></td></tr><tr><td>Mezcladores de vórtice digitales</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Categoría#D2650</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf Safe-Lock 1.5&nbsp; Ml</td><td>Eppendorf</td><td>Gato#022363204</td><td></td></tr><tr><td>Kit de detección de micoplasma EZ-PCR</td><td>Industrias biológicas</td><td>Categoría # 20-700-20</td><td></td></tr><tr><td>Suero fetal bovino, calificado, Australia</td><td>Gibco</td><td>Gato#10099141</td><td></td></tr><tr><td>Suplemento GlutaMAX</td><td>Gibco</td><td>Gato#35050061</td><td></td></tr><tr><td>GraphPad Prisma 9</td><td>GraphPad Software</td><td>https://www.graphpad.com/</td><td></td></tr><tr><td>HepG2</td><td>Colección Nacional de Cultivos Celulares Autentificados</td><td>#CSTR:19375.09.3101HUMSCSP510&nbsp; http://www.cellbank.org.cn/</td><td></td></tr><tr><td>Aceite de inmersión tipo 37</td><td>Laboratorios Cargille</td><td>Gato #16237</td><td></td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Cat#I5500-50MG</td><td>Cálido a 37 ° C antes de usar</td></tr><tr><td>LB Caldo (1x)</td><td>Invitrogen</td><td>Gato#10855001</td><td></td></tr><tr><td>Medio Mínimo Esencial (MEM)</td><td>Gibco</td><td>Gato#11095080</td><td>Cálido a 37 ° C antes de usar</td></tr><tr><td>mySPIN 12&nbsp; mini centrífuga</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>NanoDrop Uno</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com</td><td></td></tr><tr><td>Lente de aceite Nikon Plan Fluor 40&times;/1.30</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>NIS-Elements-AR</td><td>Nikon</td><td>https://www.nikon.com/</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos no esenciales (NEAA) (100x)</td><td>Gibco</td><td>Gato#11140050</td><td></td></tr><tr><td>Placas de agar LB de un solo disparo&nbsp;</td><td>Invitrogen</td><td>Modelo#A55802</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl3 químicamente competente E.&nbsp; Coli</td><td>Invitrogen</td><td>Gato#C737303</td><td></td></tr><tr><td>Parafilm</td><td>PARAFILM</td><td>Gato#B8R05606</td><td></td></tr><tr><td>PBS (solución salina tamponada con fosfato)</td><td>Gibco</td><td>Gato#10010023</td><td></td></tr><tr><td>pEevee-iAkt-NES (7,033&nbsp; bp)</td><td>Miura et et al31</td><td>https://benchling.com/s/seq-q46zFYCfl0swLAun0t28/edit</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-estreptomicina</td><td>Gibco</td><td>Gato#15070063</td><td></td></tr><tr><td>Profiláctico de plasmocina</td><td>InvivoGen</td><td>Cat#ant-mpp</td><td></td></tr><tr><td>Bromhidrato de poli-L-lisina&nbsp;</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>Categoría#P4832</td><td></td></tr><tr><td>Baños de precisión de uso general</td><td>Thermo Scientific</td><td>https://www.thermofisher.com/</td><td></td></tr><tr><td>Kit de minipreparación de giro QIAprep</td><td>QIAGEN</td><td>Categoría#27106</td><td></td></tr><tr><td>SnapGene</td><td>SnapGene de Dotmatics</td><td>https://www.snapgene.com</td><td></td></tr><tr><td>Piruvato de sodio (100 mM)</td><td>Gibco</td><td>Gato#11360070</td><td></td></tr><tr><td>Unidad de filtro de jeringa, 0.22&nbsp; &mu; m</td><td>Millipore</td><td>Gato#SLGP033RS</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora superior de Tokai Hit stage</td><td>GOLPE TOKAI</td><td>https://www.tokaihit-livecell.com/stagetopincubator</td><td></td></tr><tr><td>Agua destilada sin DNasa/RNasa UltraPure</td><td>Invitrogen</td><td>Gato#10977015</td><td></td></tr><tr><td>Reactivo de transfección Xfect</td><td>Biografía de Takara</td><td>Gato#631317</td><td></td></tr></tbody></table>

imágenes de transferencia de energía por resonancia de förster de células vivas de la dinámica de activación de akt regulada metabólicamente en células hepg2

Live-Cell F&#246;rster Resonance Energy Transfer Imaging of Metabolically Regulated Akt Activation Dynamics in HepG2 Cells

Para investigar la activación de Akt en las células HepG2, las células se sembraron en placas de imagen prerrevestidas y se transfectaron con el biosensor pEevee-iAkt-NES basado en FRET (Figura 2A), diseñado para permitir el monitoreo en tiempo real de la fosforilación de Akt. Después de la transfección, las células se sometieron a inanición sérica durante 4 h en un medio libre de suero para sincronizar su estado metabólico y minimizar la señalización de insulina basal.
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Imágenes de transferencia de energía por resonancia de Förster de células vivas de la dinámica de activación de Akt regulada metabólicamente en células HepG2

Metabolically regulated Akt activation is a critical node in the insulin signaling cascade and provides valuable insights into the relationship between ...

La heterogeneidad celular es un obstáculo para la descripción precisa de las complejidades de la dinámica celular, que esencialmente se promedian. Es por eso que estamos aquí para obtener imágenes de células individuales. Los desarrollos recientes en biosensores FRET codificados genéticamente han mejorado la especificidad y revolucionado el seguimiento en tiempo real de Akt dentro de las células, lo cual es fundamental para comprender la heterogenética y desarrollar terapias farmacológicas personalizadas.El cáncer y la diabetes se encuentran a través de vías metabólicas complejas. Para decodificar la biocomplejidad de la vía de señalización de la insulina en el cáncer, utilizamos imágenes FRET de células vivas de vanguardia con resolución unicelular. Descubrimos que la optimización del microscopio confocal, la configuración del hardware y el software, junto con el ajuste fino de la potencia del láser y el ajuste de la ganancia del detector, son fundamentales para minimizar cualquier ruido y diafonía espectral en las señales FRET.Los métodos tradicionales a granel como el western blot carecen de detalles espacio-temporales y enmascaran la heterogeneidad celular. Nuestro protocolo llena este vacío mediante el uso de imágenes FRET de células vivas para capturar la respuesta celular con alta precisión y exactitud. Para comenzar, agregue un mililitro de una solución de poli-L-lisina de 0.1 miligramos por mililitro a un plato de imágenes y agite el plato para cubrir toda la superficie.Después de la incubación durante la noche, aspire el exceso de solución de poli-L-lisina del plato. Enjuague suavemente la superficie con PBS 3 veces, descansando durante cinco minutos cada una para eliminar completamente la poli-L-lisina no unida. Aspire el PBS y seque al aire el plato de imágenes recubierto a 37 grados Celsius durante al menos tres horas.A continuación, siembre las células HepG2 en el plato de imágenes prerrevestido de 24 a 48 horas antes de la transfección para asegurarse de que alcancen una confluencia del 70 al 90%. Descongele y divida en vórtice el reactivo de transfección junto con el plásmido que codifica el biosensor de transferencia de energía de resonancia Forster. Realice un giro corto para recoger toda la mezcla en el fondo del tubo.Mezcle ocho microgramos del plásmido con el tampón de reacción hasta obtener un volumen final de 100 microlitros usando un vórtice durante cinco segundos a alta velocidad. Realice un giro corto para recoger la mezcla en el fondo del tubo. Agregue 2,4 microlitros del polímero de transfección al tubo que contiene el ADN plasmático diluido y mezcle bien.Incube la mezcla de biosensor y polímero a 37 grados Celsius durante 15 minutos para permitir que se formen complejos de nanopartículas. Gira el tubo durante cinco segundos a 5.000 G para recoger el contenido en la parte inferior. Agregue los 100 microlitros completos de solución de complejo de nanopartículas gota a gota al medio de cultivo celular y mueva suavemente la placa hacia adelante y hacia atrás para mezclar.Incube la placa a 37 grados centígrados durante cuatro horas o toda la noche. Después de eliminar los complejos de nanopartículas de las células, reemplace la solución con dos mililitros de medio de crecimiento completo fresco. Regrese la placa a la incubadora de 37 grados centígrados hasta el momento del análisis.Analizar las células bajo microscopía de fluorescencia. Retire el medio de cultivo de la placa de imagen y enjuague la placa dos veces con 1X PBS, permitiendo que cada enjuague dure cinco minutos. Agregue dos mililitros de medio de inanición a cada plato alrededor del borde del plato.Incube las células a 37 grados centígrados durante cuatro horas. A continuación, encienda la computadora, luego encienda la unidad principal del microscopio confocal y los accesorios secuencialmente. Después de eso, active el sistema láser girando la llave a la posición de encendido y accionando los interruptores de palanca de lanzamiento del láser.Luego, gire los interruptores de bloqueo láser en el sentido de las agujas del reloj a la posición de encendido para ambas líneas láser. Finalmente, encienda el controlador del sistema. Inicie el software NIS-Elements AR desde el escritorio.Haga clic en A1 para la adquisición para iniciar la configuración de imágenes y seleccionar las configuraciones ópticas apropiadas en función de los requisitos experimentales. Instale la incubadora superior de la platina del microscopio y asegúrela con tornillos. Llene el baño de agua interno con agua estéril de doble destilación.Luego, instale el calentador superior y encienda la fuente de alimentación para el calentador de escenario, el calentador de baño y el calentador de lentes. Limpie la lente de inmersión en aceite 40X con papel humedecido con etanol al 95% y coloque una pequeña gota de aceite de inmersión en la lente del objetivo. Luego, coloque el plato de imágenes que contiene las células HepG2 en la platina del microscopio y asegúrelo con el soporte.Cierre la cámara e incube las células durante una o dos horas para permitir el equilibrio. Inicie la ventana de adquisición ND desde el menú Archivo del NIS-Elements AR. Seleccione la pestaña Tiempo para establecer el intervalo, la duración y los bucles para las imágenes de lapso de tiempo. Haga clic en la pestaña XY y presione el botón Agregar para incluir las células HepG2 para obtener imágenes bajo foco.Luego, marque la casilla Z para establecer la posición Z. Haga clic en Examinar para seleccionar una carpeta de destino. Escriba el nombre del experimento en el cuadro Nombre de archivo.Haga clic en Ejecutar ahora para iniciar la adquisición e iniciar el proceso de creación de imágenes de lapso de tiempo. Registre las mediciones de referencia durante un máximo de 30 minutos sin medios suplementados con insulina. Pausa las imágenes a intervalos regulares.Retire suavemente el medio del plato con fondo de vidrio y agregue un mililitro de medio complementado con la concentración de insulina adecuada. Reanude la adquisición de imágenes y haga clic en Finalizar al final del experimento para cerrarlo. Finalmente, haga una copia de seguridad y almacene de forma segura las imágenes adquiridas para su análisis.Se observó un aumento dependiente de la dosis en la fosforilación de Akt tras la estimulación con insulina, con un fuerte aumento de 300 insulina picomolar. Más allá de esta concentración, los niveles de fosforilación se estabilizaron y no disminuyeron incluso después de que se disminuyó la insulina. La relación FRET normalizada mostró una tendencia similar, con una señal creciente tras la estimulación con insulina y la falta de retorno a la línea de base tras la retirada de insulina.Tras la estimulación secuencial de la insulina, se observó un aumento progresivo en la relación FRET normalizada, lo que respalda la respuesta de activación de Akt dependiente de la dosis.

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Research

Investigación

JoVE Journal

Cancer Research

Investigación del cáncer

FRET basada en los periodistas están cada vez más utilizado para monitorear las actividades de quinasa y fosfatasa en las células vivas. Aquí se describe un método sobre el uso de FRET basada en la prensa para evaluar el ciclo celular dependiente de los cambios en la fosforilación de destino.

Seguimiento de las actividades de quinasa y fosfatasa través del ciclo celular por Proporcional FRET

Leucina ricos repetir las quinasas 1 y 2 (LRRK1 y LRRK2) son proteínas multidominio que codifican tanto GTPasa y dominios quinasa y que son fosforilados en las células. Aquí, se presenta un protocolo para etiquetar LRRK1 y LRRK2 en las células con 32 P ortofosfato, proporcionando así un medio para medir sus niveles generales de fosforilación celular.

Metabólicas etiquetado de repeticiones ricas en leucina quinasas 1 y 2 con Radioactive Fosfato

MRP4 regula diversos eventos de señalización de nucleótidos cíclicos dependiente incluyendo un papel recientemente dilucidado en la migración celular. Se describe un enfoque directo, pero multifacética para desentrañar las dianas moleculares aguas abajo de MRP4 que resulta en la identificación de un interactoma MRP4 único que juega un papel clave en la regulación afinado de la migración de fibroblastos.

Métodos de estudio de complejos macromoleculares que contienen MRP4-en el Reglamento de Migración de fibroblastos

Aquí se presenta un protocolo para obtener imágenes de células que expresan receptores de proteína verde fluorescente con etiquetas de tipo 1a angiotensina durante la endocitosis iniciados por el tratamiento de la angiotensina II. Esta técnica incluye los lisosomas de etiquetado con un segundo marcador fluorescente, y luego utilizando software para analizar la co-localización de receptor y lisosoma en tres dimensiones con el tiempo.

Imágenes de células vivas y análisis 3D del receptor de angiotensina Tipo 1a Tráfico transfectadas en células de riñón embrionarias humanas Utilizando microscopía confocal

El láser de femtosegundo sin enfoque puede proporcionar una estimulación precisa a las células al acoplarse en una microscopía confocal que permite la observación en tiempo real y la fotoestimulación. La fotoestimulación puede activar eventos moleculares celulares, incluyendo la vía de señalización ERK y destellos mitocondriales de especies reactivas de oxígeno.

Fotoestimulación por láser de femtosegundo activa la señalización de la quinasa regulada por señal extracelular (ERK) o eventos mitocondriales en células objetivo

Células progenitoras hematopoyéticas (HSPC) transición de un estado de reposo a un estado de diferenciación debido a su plasticidad metabólica durante la formación de sangre. Aquí, presentamos un método optimizado para medir la respiración mitocondrial y la glucólisis de los HSCCP.

Análisis del metabolismo de células hematopoyéticas del progenitor del tallo

Los protocolos de ensayo basados en células de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo se describen para la cuantificación simple, específica, sensible y robusta del transductor de señal fosforilada endógena y el activador de la transcripción (STAT) 1/3/4/5/6 proteínas en lisados celulares en un formato de 384 pocillos.

Ensayos de transferencia de energía de resonancia de Förster resueltos en el tiempo para la medición de proteínas STAT fosforiladas endógenas en células humanas

El ensayo de flujo metabólico celular en tiempo real mide la tasa de consumo de oxígeno y la tasa de acidificación extracelular, que corresponde a la producción mitocondrial y glicolítica de trifosfato de adenosina, utilizando sensores de pH y oxígeno. El manuscrito explica un método para comprender el estado energético de los osteoblastos y la caracterización e interpretación del estado bioenergético celular.

Uso del analizador de flujo metabólico celular en tiempo real para monitorear la bioenergética de osteoblastos

Este protocolo describe imágenes de fluorescencia y análisis de las coenzimas metabólicas endógenas, nicotinamida adenina (fosfato) dinucleótido reducido (NAD(P)H) y dinucleótido de flavina adenina oxidada (FAD). Las imágenes de autofluorescencia de NAD(P)H y FAD proporcionan un método no destructivo sin etiquetas para evaluar el metabolismo celular.

Imágenes de autofluorescencia para evaluar el metabolismo celular

Presentamos un protocolo para visualizar directamente las actividades metabólicas en células reguladas por aminoácidos utilizando microscopía de dispersión Raman estimulada con sonda de óxido de deuterio (agua pesada D2O) (DO-SRS), que se integra con microscopía de fluorescencia por excitación de dos fotones (2PEF).

Imagen química bioortogonal del metabolismo celular regulado por aminoácidos aromáticos

Este protocolo integra un sistema de biorreactor hecho a medida con espectroscopia de RMN de ¹³C hiperpolarizada para medir el metabolismo del piruvato en tiempo real en células vivas, lo que mejora la reproducibilidad y la precisión cinética para estudios metabólicos y aplicaciones de detección de fármacos.

Detección metabólica en tiempo real en células vivas mediante RMN hiperpolarizada de 13C

Aprende a cuantificar la dinámica espaciotemporal de la activación de Akt en células HepG2 mediante imágenes FRET. Este protocolo permite estudiar la señalización de insulina y la regulación metabólica en cáncer.

Imágenes de transferencia de energía por resonancia de Förster de células vivas de la dinámica de activación de Akt regulada metabólicamente en células HepG2 (Video) | JoVE Journal

Imágenes de transferencia de energía por resonancia de Förster de células vivas de la dinámica de activación de Akt regulada metabólicamente en células HepG2

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