Generación y caracterización de astrocitos derivados de células madre pluripotentes inducidas humanamente que carecen de ribonucleoproteína mensajera X frágil

Este trabajo se centra en cuatro astrocitos humanos específicos del cerebro y cómo se ven alterados por trastornos del neurodesarrollo como el síndrome X frágil. Trabajos anteriores utilizaron modelos animales para estudiar principalmente neuronas, por lo que este trabajo agrega una nueva dimensión a esta área de investigación.

Los conocimientos mecanicistas de los estudios en animales han tenido un éxito clínico limitado. El principal desafío es obtener conocimientos similares sobre las neuronas y los astrocitos de origen humano.

Nuestro protocolo generó con éxito astrocitos funcionales para el viento, que exhiben un metabolismo desregulado, glucolítico y mitocondrial en el síndrome X frágil, lo que permite investigar el papel de las células gliales en la biología de la enfermedad. A pesar de la creciente evidencia sobre el papel clave de la glía en la función neuronal en la salud y la enfermedad, se sabe poco sobre cómo se ven afectados los astrocitos humanos en los trastornos del neurodesarrollo, como el síndrome X frágil.

De cara al futuro, nos basaremos en este marco para estudiar cómo los astrocitos y sus interacciones con las neuronas se ven alterados por la enfermedad, y luego cómo estos pueden corregirse mediante intervenciones terapéuticas.

[Instructor] Para comenzar, cubra un plato de seis hinchamientos con Matrigel diluido en una proporción de uno a 60 en DMMF avanzado 12. Guarde el plato recubierto a una temperatura de dos a ocho grados centígrados. El día del cultivo, retire el material de recubrimiento del plato y agregue un mililitro de medio esencial completo, junto con un inhibidor de rocas a una concentración final de un X. Coloque el plato dentro de una incubadora. Establezca a 37 grados Celsius con un 5% de dióxido de carbono antes de agregar las células madre pluripotentes inducidas por humanos, o IPSC. Siembre las IPSC humanas en un medio esencial completo con el inhibidor de roca a una concentración final de una X para mejorar la adherencia de la colonia. Al día siguiente, reemplace el medio esencial completo de ocho con medio nuevo, sin el inhibidor de rocas. Continúe reponiendo el medio diariamente hasta que las células alcancen el 80% de confluencia, lo que demora aproximadamente de cuatro a cinco días. Cuando las colonias alcancen el 80% de confluencia, agregue una mezcla de colagenasa y dispasa para separarlas enzimáticamente del plato. Una vez que las colonias comiencen a levantarse, retire el plato de la incubadora y agregue dos mililitros de DPBS para neutralizar la actividad enzimática. Usando DPBS, raspe las colonias y recoja la suspensión en un tubo cónico de 15 mililitros, usando una pipeta serológica de cartón ancho de 10 mililitros. Luego, con una pipeta serológica de 10 mililitros, triture suavemente la suspensión dos o tres veces para romper las colonias. Permita que las colonias se asienten. Después de aproximadamente dos minutos, aspire la mezcla de enzimas DPBS dejando aproximadamente un mililitro de líquido en el tubo. Luego agregue dos mililitros de DPBS al tubo y mezcle golpeando suavemente para volver a suspender las colonias. Deje que se asienten y repita este proceso dos veces para eliminar la enzima residual. Después de quitar el sobrenadante, vuelva a suspender las colonias en un mililitro de ocho medios esenciales completos y colóquelas en un plato recubierto de Matrigel recién preparado. Levante enzimáticamente las células madre pluripotentes inducidas por humanos como se describió anteriormente. Colóquelos en una placa de cultivo en suspensión no adherente de 100 milímetros con un medio químicamente definido. Coloque la suspensión celular en un agitador orbital a 40 revoluciones por minuto durante siete días en condiciones normóxicas para facilitar el desarrollo de esferas corticales. El día ocho, transfiera las esferas de cortico a un medio de proliferación celular y manténgalas durante siete días. Para inducir la especificación glial, incube las esferas de cortico en un medio de enriquecimiento glial durante dos semanas para obtener esferas de glía tempranas. Para la maduración de las esferas gliales tempranas, reemplace el factor de crecimiento de fibroblastos H básico con 20 nanogramos por mililitro de factor inhibidor de la leucemia y mantenga las esferas durante cuatro semanas.

Después de cuatro semanas en medio de maduración, continúe manteniendo las esferas en medio de enriquecimiento glial durante períodos prolongados. Para evitar la agregación y la pérdida de viabilidad, corte mecánicamente las esferas de glía cada dos semanas, utilizando una cuchilla industrial estéril. Reemplace todo el medio con DNasa uno para eliminar los fragmentos de ADN generados por el corte. A continuación, disocie las esferas de glía en monocapas de células progenitoras de astrocitos, utilizando un kit de disociación de papaína. Coloque las células disociadas en un cultivo celular, trate con una placa adherente previamente recubierta con Matrigel a una dilución de uno a 80. Propagar las células progenitoras de astrocitos en medio de enriquecimiento glial hasta que alcancen el 80% de confluencia. El paso las células extraen el medio gastado y lo recogen en un tubo cónico. Agregue medio de desprendimiento de células enzimáticas a las células y espere uno o dos minutos. Una vez que las células comiencen a desprenderse, agregue el medio gastado para neutralizar la actividad enzimática. Recoger la suspensión celular y centrifugar a 800 G durante dos minutos. Después de desechar el sobrenadante, vuelva a suspender las células en un medio de enriquecimiento glial. Coloque aproximadamente una vez 10 a la potencia de seis celdas por pocillo en un plato recubierto de Matrigel a una dilución de uno a 80. Para la crioconservación, vuelva a suspender el sedimento celular en una mezcla fría de 90% de medio de proliferación de esferas de cortico y 10% de crioprotector. Transfiera las células resuspendidas a viales criogénicos. Mueva inmediatamente los viales criogénicos a una caja criogénica y guárdelos en un congelador a menos 80 grados centígrados durante la noche. Al día siguiente, transfiera todos los viales criogénicos a un tanque de nitrógeno líquido para su almacenamiento a largo plazo. Caracterice las células progenitoras de astrocitos disociadas mediante inmunotinción con marcadores de Vimenton y factor nuclear IAM. Para confirmar la especificidad regional de los cuatro cerebros de las APC derivadas de IPSC humanas, realice un análisis QPCR en tiempo real para la caja de cabeza de horquilla humana G1 y la caja homeo humana, B4. Diferenciar las APC en astrocitos y medio de diferenciación astrocítica durante 14 días. Coloque astrocitos en placa en un plato con fondo de vidrio de 35 milímetros a una densidad de cinco veces 10 a la potencia de tres células por plato para medir su respuesta a la adenosina cinco trifosfato. Deje que las celdas se adhieran al fondo de vidrio durante 24 horas. Lave las células adheridas tres veces con la solución salina equilibrada sin calcio de Hank. Luego incube las células en el medio de cultivo que contiene cinco diureide métrico de relación micromolar 2:00 AM y 0.02% de plurónico F127 durante una hora a temperatura ambiente. Después de lavar las células dos veces con medio de cultivo, reemplace el medio con dos milimolares de calcio que contengan la solución de sal equilibrada de Hank. Imágenes de las células a dos fotogramas por segundo, utilizando un objetivo de inmersión en aceite de 60X en un microscopio invertido de compensación de deriva enfocada. Finalmente, registre las respuestas de calcio inducidas por ATP después de agregar ATP a una concentración final de cinco milimolares en la marca de 25 segundos. Las colonias humanas de IPSC expresaron marcadores pluripotentes opt four y nano como se confirma mediante inmunotinción. Las APC derivadas del síndrome X frágil y las líneas de control mostraron proporciones comparables de vimentina y células positivas para NFIA. Las células progenitoras de astrocitos de las células madre pluripotentes inducidas por humanos tanto del síndrome de X frágil como del síndrome X frágil exhibieron una regulación positiva de Fox G1, en comparación con HOXB4, lo que indica una identidad del prosencéfalo. Los astrocitos derivados de las líneas humanas del síndrome de X frágil IPSC mostraron un número reducido de expresión de GFAP. Los astrocitos de control y síndrome de X frágil exhibieron transitorios de calcio inducidos por ATP, pero el número de respondedores fue significativamente menor en los astrocitos del síndrome de X frágil. La amplitud máxima del primer transitorio de calcio evocado por ATP fue significativamente menor en los astrocitos del síndrome X frágil en comparación con las células de control. Los astrocitos del síndrome X frágil derivados de IPSC humanos mostraron un aumento en la glucólisis, la capacidad glucolítica y las reservas glucolíticas, pero mostraron una disminución significativa en la respiración máxima en comparación con los astrocitos de control.