Name: Edición del epigenoma CRISPR en células humanas mediante transfección de ADN plasmídico y administración de nucleofección de ARNm (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:40:00.000+00:00
Duration: 7 min 49 s
Description: Aprenda a editar el epigenoma en células humanas mediante transfección de ADN plasmídico y nucleofección de ARNm con dCas9. Este método permite modular genes sin romper el ADN, reduciendo toxicidad e inestabilidad genómica.

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Aunque el contenido genómico de cada célula de nuestro cuerpo es casi idéntico, el perfil transcripcional de cada tipo de célula difiere enormemente. Las modificaciones epigenéticas en el ADN y las proteínas histonas son reguladores clave de la expresión transcripcional. La eucromatina transcripcionalmente activa se caracteriza por marcas epigenéticas distintas en comparación con la heterocromatina compacta y transcripcionalmente inactiva. Por ejemplo, las regiones heterocromáticas se definen por modificaciones represivas de histonas, incluida la trimetilación en la lisina 9 de la histona 3 (H3K9me3), la trimetilación en la lisina 27 de la histona H3 (H3K27me3) y la metilación del ADN en las citosinas junto a las guaninas (CpG) en los promotores del gen1. Las regiones genómicas de la expresión génica activa se definen típicamente por la acetilación y trimetilación de histonas en la lisina 4 de la histona 3 (H3K4me3)1.
La revolución de las repeticiones palindrómicas cortas agrupadas y regularmente interespaciadas (CRISPR) ha generado una gran cantidad de herramientas que permiten la alteración programada de las secuencias genómicas. La tecnología CRISPR se basa en un mecanismo de defensa procariota capaz de escindir ácidos nucleicos en secuencias diana programables. Las nucleasas CRISPR 2,3,4, los editores de bases 5,6 y los editores primarios 7,8 pueden cambiar la secuencia de ADN de los genomas de los mamíferos mediante el corte del ADN y la reparación de estas roturas. Aunque efectivas, estas estrategias pueden causar roturas de ADN en sitios fuera del objetivo 9,10 y mutaciones estructurales genómicas a gran escala 11,12,13,14,15. Las herramientas alternativas basadas en CRISPR permiten una modulación manejable de la activación y represión de genes sin cambiar la secuencia de ADN subyacente. Estas herramientas aprovechan una deficiencia de nucleasa Cas9 (dCas9), lo que permite la unión del ADN en los sitios objetivo dictados por la secuencia de sgRNA, en combinación con proteínas efectoras que alteran el paisaje de la cromatina 16,17,18. Las proteínas efectoras, como los escritores epigenéticos, los lectores y los borradores, pueden fusionarse directamente con dCas9 o reclutarse mediante un andamio peptídico fusionado con dCas9, como SunTag, o un andamio de ARN en el sgRNA, como el sistema MS2-MCP 16,17,18. Algunos ejemplos de herramientas de control de transcripción programables son la activación de CRISPR (CRISPRa)19,20,21 y la interferencia de CRISPR (CRISPRi)22,23. CRISPRa funciona reclutando directamente la maquinaria de transcripción, aumentando la expresión génica transcripcional diana19. Por el contrario, CRISPRi reprime la transcripción mediante el establecimiento de H3K9me3, una marca epigenética represiva22.
Los avances en la edición del epigenoma han permitido un amplio uso de estas herramientas en todos los campos científicos. Las fusiones de diferentes dominios efectores y proteínas han ampliado el conjunto de herramientas de editores de epigenomas disponibles 18,24,25,26,27,28,29,30. Además, los editores del epigenoma se utilizan para descifrar las funciones de las modificaciones epigenéticas 31,32,33,34,35,36, los efectores 37,38,39 y las mutaciones efectoras 28,40,41 en la regulación génica. En concreto, CRISPRi y CRISPRa se utilizan en cribados de genómica funcional para una variedad de procesos biológicos, incluyendo la supervivencia celular42 y el destino celular 43,44,45,46,47. Además, la edición del epigenoma tiene potencial terapéutico para la ingeniería celular ex vivo y las terapias in vivo 18.
Aquí, describimos los métodos para aplicar dos editores de epigenoma basados en dCas9 para la represión transcripcional programable en líneas celulares humanas: CRISPRi22 y CRISPRoff48. CRISPRi es una fusión de dCas9 con el dominio represivo KRAB a partir de una proteína de dedos de zinc como ZNF10 (KOX1) y ZIM322,23. Cuando CRISPRi se dirige a un promotor genético específico, el dominio KRAB recluta a un escritor H3K9me3, SETDB1, para reprimir el gen objetivo (Figura 1A). Cuando CRISPRi se expresa de forma transitoria, el H3K9me3 establecido en el locus diana no se mantiene y la expresión génica se restablece con el tiempo32,48. Para llevar a cabo knockdowns estables utilizando CRISPRi, como en las aplicaciones de genómica funcional, es esencial la expresión constitutiva de CRISPRi en las células junto con el sgRNA. Recientemente, CRISPRoff fue diseñado para programar la edición del epigenoma hereditario48. CRISPRoff es una fusión de una sola proteína de dCas9 con el dominio KRAB y el complejo de ADN metiltransferasa de novo, DNMT3A y DNMT3L. Un pulso transitorio de CRISPRoff en células humanas programa la deposición de H3K9me3 y la metilación del ADN en los genes objetivo, lo que conduce a la represión a largo plazo de los genes objetivo mediante el mantenimiento de la metilación del ADN y H3K9me3 (Figura 1B)48. Además, las ediciones del epigenoma se pueden revertir. Por ejemplo, un gen que es silenciado de manera estable por CRISPRoff puede ser reactivado por TET1-dCas9, que puede eliminar enzimáticamente las marcas de metilación del ADN en los lociobjetivo 49.
Este protocolo detallará dos métodos de administración para la expresión transitoria de los editores del epigenoma: la transfección de ADN plasmídico y la nucleofección de ARNm. Además, describimos cómo utilizar la citometría de flujo para evaluar la eficacia de la edición del epigenoma en dos genes endógenos, CLTA y CD55. Estos métodos se pueden adaptar y aplicar a otros experimentos de edición del epigenoma utilizando editores adicionales o se pueden usar para apuntar a diferentes genes.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68089/68089fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema del mecanismo de edición del epigenoma de CRISPRi y CRISPRoff y el flujo de trabajo. (A) Esquemas lineales del transgén sgRNA y editor del epigenoma CRISPRi. La adición de CRISPRi y sgRNA permite la adición de la marca de histonas represiva H3K9me3 para silenciar el locus objetivo. El nivel más alto de silenciamiento se logra temprano después de la adición de CRISPRi, y el gen objetivo generalmente se reactiva después de unos pocos pasos. (B) Esquemas lineales del transgén sgRNA y editor del epigenoma CRISPRoff. La adición de CRISPRoff a las células que se dirigen a un gen de interés conduce a la adición de H3K9me3 represivo junto con la metilación del ADN en los sitios CpG para silenciar el gen objetivo. El silenciamiento por CRISPRoff es hereditario: el alto nivel de silenciamiento se logra temprano durante la transfección y persiste a lo largo de múltiples divisiones celulares. (C) Descripción general de la línea de tiempo para la edición del epigenoma a través del método de transfección. En el día 0, las células se siembran para la transfección. El día 1, el editor y el plásmido guía se pueden introducir en las células a través de la transfección. El día 3, se evaluará la expresión de BFP de las células mediante citometría de flujo. El porcentaje de BFP se utiliza como factor normalizador para determinar la eficacia final de silenciamiento del experimento para cada condición. A partir del día 6, se analizan las células para silenciar al reportero de interés, ya que el nivel más alto de silenciamiento se alcanzará en este día. (D) Descripción general del método de transfección en el que el editor del epigenoma y los plásmidos de sgRNA se agregan a las células de manera gota a gota. (E) Visión general de la línea de tiempo para la edición del epigenoma a través de los métodos de nucleofección. En este protocolo, el ARNm es la nucleofección en las células en el día 0. Se evalúa el silenciamiento de las células en el día 3 después de la nucleofección mediante análisis de citometría de flujo. (F) Descripción general del protocolo de nucleofección. Se mezclan cantidades adecuadas de células y ARNm y se añaden a las cubetas nucleofectoras. Si el sgRNA se introduce por nucleofección, también se puede añadir a esta mezcla. Las cubetas se colocan en el nucleofector y se utilizan los códigos de pulso apropiados para introducir el ARNm en las células. Después de la nucleofección, las células se colocan en placas y se pasan para su análisis en días posteriores. (G) Comparación entre la transfección de plásmidos y las estrategias de nucleofección de ARNm para la edición del epigenoma. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68089/68089fig01large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>4D-Nucleofector</td><td>Lonza</td><td>AAF-1003</td><td></td></tr><tr><td>Placas de cultivo de tejidos de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>3596</td><td></td></tr><tr><td>Placa inferior en U de 96 pocillos</td><td>Corning</td><td>351177</td><td></td></tr><tr><td>APC anti-humano Anticuerpo CD55</td><td>BioLegend</td><td>311312</td><td></td></tr><tr><td>BD FACSymphony A1 Citómetro de flujo</td><td>BD Biosciences</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Bleach</td><td>Waxie</td><td></td><td></td>11003428432</tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5425</td><td></td></tr><tr><td>Countess Contador de células automatizado</td><td>Thermo Scientific</td><td>Countess 3</td><td></td></tr><tr><td>CRISPRoff plásmido de transfección</td><td>Addgene&nbsp;</td><td></td><td></td>167981</tr><tr><td>Diluyente 2 Reactivo de hematología para citometría de flujo (líquido de vaina)</td><td>Thermo Scientific</td><td>23-029-361</td><td></td></tr><tr><td>DMEM, alta glucosa</td><td>Thermo Scientific</td><td>11965118</td><td></td></tr><tr><td>DPBS</td><td>Gibco</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>Tubos Eppendorf</td><td>Thomas scientific</td><td>1159M35</td><td></td></tr><tr><td>FBS</td><td>Avantor Seradigm</td><td>89510-186</td><td></td></tr><tr><td>Lonza Walkersville&nbsp; Línea celular SF 4D-Nucleofector X Kit L</td><td>Fisher Scientific</td><td>NC0281111</td><td></td></tr><tr><td>mMESSAGE mMACHINE&trade; Kit de transcripción T7 ULTRA</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM1345</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM</td><td>Gibco</td><td>31985070</td><td></td></tr><tr><td>tubos de tiras de PCR</td><td>EE. UU. Scientific&nbsp;</td><td>1402-4700</td><td></td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>10378016</td><td></td></tr><tr><td>plásmido de expresión de sgRNA pLG1</td><td>Addgene &nbsp;</td><td></td><td></td>217306</tr><tr><td>RPMI 1640</td><td>Gibco</td><td>22-400-105</td><td></td></tr><tr><td>SF Línea celular Nucleofector de 96 pocillos&reg; &nbsp; Kit</td><td>Lonza</td><td>V4SC-2096</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de cultivo de tejidos</td><td>PHCbi</td><td>MCO-170AICUVDL-PA</td><td></td></tr><tr><td>TransIT-LTI reactivo de transfección</td><td>Mirus</td><td>MIR 2306</td><td></td></tr><tr><td>Tripsina-EDTA (0.25%)</td><td>Gibco</td><td>25200114</td><td></td></tr></tbody></table>

edición del epigenoma crispr en células humanas mediante transfección de adn plasmídico y administración de nucleofección de arnm

CRISPR Epigenome Editing in Human Cells using Plasmid DNA Transfection and mRNA Nucleofection Delivery

Para todos los experimentos de edición del epigenoma, los controles adecuados son fundamentales para evaluar la eficiencia de la edición del epigenoma. Recomendamos utilizar un sgRNA de control, que no se dirija a ninguna secuencia del genoma humano. El uso de un control guía no dirigido dará la confianza de que los cambios en los loci objetivo son impulsados por el editor del epigenoma que se dirige a ese sitio en lugar de solo por la sobreexpresión del editor del epigenoma o la unión no específica. Además, para los exp...

Edición del epigenoma CRISPR en células humanas mediante transfección de ADN plasmídico y administración de nucleofección de ARNm

Epigenetics refers to chemical modifications of histone proteins and DNA that can regulate the expression of genes. The human epigenome is altered ...

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Research

Investigación

JoVE Journal

Genetics

Genética

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Plataforma de vectores lentivirales para la entrega eficiente de las herramientas de edición de epigenoma en humanos inducida por modelos de enfermedad derivados de células madre pluripotentes

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Edición genómica en células primarias de mamíferos mediante electroporación del ARN editor

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Edición del epigenoma CRISPR en células humanas mediante transfección de ADN plasmídico y administración de nucleofección de ARNm (Video) | JoVE Journal

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