Name: Monitorización de la dinámica conformacional de proteínas individuales no modificadas mediante nanopinzas plasmónicas (Video) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-03-21T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 33 s
Description: Aprende a utilizar nanopinzas plasmónicas para monitorizar la dinámica conformacional de proteínas individuales sin modificar. Esta técnica permite estudiar proteínas relevantes en enfermedades como Alzheimer y Parkinson.

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<ol><li>Peter Lu, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Sizing+up+single-molecule+enzymatic+conformational+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Chem+Soc+Rev%22%5BJournal%5D)">Sizing up single-molecule enzymatic conformational dynamics.</a> Chem Soc Rev. 43 (4), 1118-1143 (2014).</li>
<li>Mazal, H., Haran, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+FRET+methods+to+study+the+dynamics+of+proteins+at+work%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Biomed+Eng%22%5BJournal%5D)">Single-molecule FRET methods to study the dynamics of proteins at work.</a> Curr Opin Biomed Eng. 12, 8-17 (2019).</li>
<li>Ritchie, D. B., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Probing+the+structural+dynamics+of+proteins+and+nucleic+acids+with+optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Probing the structural dynamics of proteins and nucleic acids with optical tweezers.</a> Curr Opin Str Biol. 34, 43-51 (2015).</li>
<li>Neupane, K., Solanki, A., Sosova, I., Belov, M., Woodside, M. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Diverse+metastable+structures+formed+by+small+oligomers+of+%CE%B1-Synuclein+probed+by+force+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">Diverse metastable structures formed by small oligomers of α-Synuclein probed by force spectroscopy.</a> PLoS One. 9 (1), e86495(2014).</li>
<li>Hughes, M. L., Dougan, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+physics+of+pulling+polyproteins%3A+a+review+of+single+molecule+force+spectroscopy+using+the+AFM+to+study+protein+unfolding%5BTitle%5D)+AND+%22Rep+Prog+Phys%22%5BJournal%5D)">The physics of pulling polyproteins: a review of single molecule force spectroscopy using the AFM to study protein unfolding.</a> Rep Prog Phys. 79 (7), 076601-076601 (2016).</li>
<li>Young, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantitative+mass+imaging+of+single+biological+macromolecules%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Quantitative mass imaging of single biological macromolecules.</a> Science. 360 (6387), 423-427 (2018).</li>
<li>Schmid, S., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopores%3A+a+versatile+tool+to+study+protein+dynamics%5BTitle%5D)+AND+%22Essays+Biochem%22%5BJournal%5D)">Nanopores: a versatile tool to study protein dynamics.</a> Essays Biochem. 65 (1), 93-107 (2021).</li>
<li>Van Meervelt, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Real-time+conformational+changes+and+controlled+orientation+of+native+proteins+inside+a+protein+nanoreactor%5BTitle%5D)+AND+%22J+Am+Chem+Soc%22%5BJournal%5D)">Real-time conformational changes and controlled orientation of native proteins inside a protein nanoreactor.</a> J Am Chem Soc. 139 (51), 18640-18646 (2017).</li>
<li>Awasthi, S., Ying, C., Li, J., Mayer, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Simultaneous+determination+of+the+size+and+shape+of+single+%CE%B1-Synuclein+oligomers+in+solution%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Simultaneous determination of the size and shape of single α-Synuclein oligomers in solution.</a> ACS Nano. 17 (13), 12325-12335 (2023).</li>
<li>Sµnchez-Rico, C., Von Vithenberg, L., Warner, L., Lamb, D. C., Sattler, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Effects+of+fluorophore+attachment+on+protein+conformation+and+dynamics+studied+by+spFRET+and+NMR+spectroscopy%5BTitle%5D)+AND+%22Chemistry%22%5BJournal%5D)">Effects of fluorophore attachment on protein conformation and dynamics studied by spFRET and NMR spectroscopy.</a> Chemistry. 23 (57), 14267-14277 (2017).</li>
<li>Yin, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((How+does+fluorescent+labeling+affect+the+binding+kinetics+of+proteins+with+intact+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Biosens+Bioelectr%22%5BJournal%5D)">How does fluorescent labeling affect the binding kinetics of proteins with intact cells.</a> Biosens Bioelectr. 66, 412-416 (2015).</li>
<li>Berkovich, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Rate+limit+of+protein+elastic+response+is+tether+dependent%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci%22%5BJournal%5D)">Rate limit of protein elastic response is tether dependent.</a> Proc Natl Acad Sci. 109 (36), 14416-14421 (2012).</li>
<li>Dahmardeh, M., Mirzaalian Dastjerdi, H., Mazal, H., Köstler, H., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-supervised+machine+learning+pushes+the+sensitivity+limit+in+label-free+detection+of+single+proteins+below+10+kDa%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Meth%22%5BJournal%5D)">Self-supervised machine learning pushes the sensitivity limit in label-free detection of single proteins below 10 kDa.</a> Nat Meth. 20 (3), 442-447 (2023).</li>
<li>Becker, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+quantitative+description+for+optical+mass+measurement+of+single+biomolecules%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Photon%22%5BJournal%5D)">A quantitative description for optical mass measurement of single biomolecules.</a> ACS Photon. 10 (8), 2699-2710 (2023).</li>
<li>Houghtaling, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Estimation+of+shape%2C+volume%2C+and+dipole+moment+of+individual+proteins+freely+transiting+a+synthetic+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Estimation of shape, volume, and dipole moment of individual proteins freely transiting a synthetic nanopore.</a> ACS Nano. 13 (5), 5231-5242 (2019).</li>
<li>Plesa, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Fast+translocation+of+proteins+through+solid+state+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Fast translocation of proteins through solid state nanopores.</a> Nano Lett. 13 (2), 658-663 (2013).</li>
<li>Schmid, S., Stömmer, P., Dietz, H., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nanopore+electro-osmotic+trap+for+the+label-free+study+of+single+proteins+and+their+conformations%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Nanotechnol%22%5BJournal%5D)">Nanopore electro-osmotic trap for the label-free study of single proteins and their conformations.</a> Nat Nanotechnol. 16 (11), 1244-1250 (2021).</li>
<li>Shi, X., Verschueren, D. V., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Active+delivery+of+single+DNA+molecules+into+a+plasmonic+nanopore+for+label-free+optical+sensing%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Active delivery of single DNA molecules into a plasmonic nanopore for label-free optical sensing.</a> Nano Lett. 18 (12), 8003-8010 (2018).</li>
<li>Verschueren, D. V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+optical+detection+of+DNA+translocations+through+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Label-free optical detection of DNA translocations through plasmonic nanopores.</a> ACS Nano. 13 (1), 61-70 (2019).</li>
<li>Verschueren, D., Shi, X., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Nano-optical+tweezing+of+single+proteins+in+plasmonic+nanopores%5BTitle%5D)+AND+%22Small+Meth%22%5BJournal%5D)">Nano-optical tweezing of single proteins in plasmonic nanopores.</a> Small Meth. 3 (5), 1800465(2019).</li>
<li>Peri, S. S. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+low+affinity+binding+interactions+between+natural+killer+cell+inhibitory+receptors+and+targeting+ligands+with+a+self-induced+back-action+actuated+nanopore+electrophoresis+%28SANE%29+sensor%5BTitle%5D)+AND+%22Nanotechnology%22%5BJournal%5D)">Quantification of low affinity binding interactions between natural killer cell inhibitory receptors and targeting ligands with a self-induced back-action actuated nanopore electrophoresis (SANE) sensor.</a> Nanotechnology. 32 (4), 045501(2020).</li>
<li>Leong, I. W., Tsutsui, M., Yokota, K., Taniguchi, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Salt+gradient+control+of+translocation+dynamics+in+a+solid-state+nanopore%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Salt gradient control of translocation dynamics in a solid-state nanopore.</a> Anal Chem. 93 (49), 16700-16708 (2021).</li>
<li>Juan, M. L., Righini, M., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Plasmon+nano-optical+tweezers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Photon%22%5BJournal%5D)">Plasmon nano-optical tweezers.</a> Nat Photon. 5 (6), 349-356 (2011).</li>
<li>Juan, M. L., Gordon, R., Pang, Y., Eftekhari, F., Quidant, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Self-induced+back-action+optical+trapping+of+dielectric+nanoparticles%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Phys%22%5BJournal%5D)">Self-induced back-action optical trapping of dielectric nanoparticles.</a> Nat Phys. 5 (12), 915-919 (2009).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+12+nm+dielectric+spheres+using+double-nanoholes+in+a+gold+film%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of 12 nm dielectric spheres using double-nanoholes in a gold film.</a> Nano Lett. 11 (9), 3763-3767 (2011).</li>
<li>Pang, Y., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+trapping+of+a+single+protein%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical trapping of a single protein.</a> Nano Lett. 12 (1), 402-406 (2012).</li>
<li>Kotnala, A., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Quantification+of+high-efficiency+trapping+of+nanoparticles+in+a+double+nanohole+optical+tweezer%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Quantification of high-efficiency trapping of nanoparticles in a double nanohole optical tweezer.</a> Nano Lett. 14 (2), 853-856 (2014).</li>
<li>Booth, L. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Modelling+of+the+dynamic+polarizability+of+macromolecules+for+single-molecule+optical+biosensing%5BTitle%5D)+AND+%22Sci+Rep%22%5BJournal%5D)">Modelling of the dynamic polarizability of macromolecules for single-molecule optical biosensing.</a> Sci Rep. 12 (1), 1995(2022).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+monitoring+of+in+situ+Iron+loading+into+single%2C+native+ferritin+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical monitoring of in situ Iron loading into single, native ferritin proteins.</a> Nano Lett. 23 (8), 3251-3258 (2023).</li>
<li>Yousefi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Structural+Flexibility+and+Disassembly+Kinetics+of+Single+Ferritin+Molecules+Using+Optical+Nanotweezers%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nano%22%5BJournal%5D)">Structural Flexibility and Disassembly Kinetics of Single Ferritin Molecules Using Optical Nanotweezers.</a> ACS Nano. 18 (24), 15617-15626 (2024).</li>
<li>Peters, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Energy+landscape+of+conformational+changes+for+a+single+unmodified+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosens%22%5BJournal%5D)">Energy landscape of conformational changes for a single unmodified protein.</a> NPJ Biosens. 1 (1), 14-14 (2024).</li>
<li>Peters, M., McIntosh, D., Branzan Albu, A., Ying, C., Gordon, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+tracking+of+proteins+through+plasmon-enhanced+interference%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Nanosci+Au%22%5BJournal%5D)">Label-free tracking of proteins through plasmon-enhanced interference.</a> ACS Nanosci Au. 4 (1), 69-75 (2024).</li>
<li>Ying, C., et al. Watching single unmodified enzymes at work. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aYing%2C+C+%22arXiv%22">arXiv</a>. , (2021).</li>
<li>Yang-Schulz, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+observation+of+small+molecule+activator+binding+to+single+PR65+protein%5BTitle%5D)+AND+%22NPJ+Biosensing%22%5BJournal%5D)">Direct observation of small molecule activator binding to single PR65 protein.</a> NPJ Biosensing. 2 (1), 1-10 (2025).</li>
<li>Yang, W., van Dijk, M., Primavera, C., Dekker, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((FIB-milled+plasmonic+nanoapertures+allow+for+long+trapping+times+of+individual+proteins%5BTitle%5D)+AND+%22iScience%22%5BJournal%5D)">FIB-milled plasmonic nanoapertures allow for long trapping times of individual proteins.</a> iScience. 24 (11), 103237(2021).</li>
<li>Koya, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Novel+plasmonic+nanocavities+for+optical+trapping-assisted+biosensing+applications%5BTitle%5D)+AND+%22Adv+Optical+Mater%22%5BJournal%5D)">Novel plasmonic nanocavities for optical trapping-assisted biosensing applications.</a> Adv Optical Mater. 8 (7), 1901481(2020).</li>
<li>Goswami, A., Umashankar, R., Gupta, A. K., Aravindan, S., Rao, P. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Development+of+a+microstructured+surface+using+the+FIB%5BTitle%5D)+AND+%22J+Micromanufact%22%5BJournal%5D)">Development of a microstructured surface using the FIB.</a> J Micromanufact. 1 (1), 53-61 (2018).</li>
<li>Onuta, T. D., Waegele, M., DuFort, C. C., Schaich, W. L., Dragnea, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Optical+field+enhancement+at+cusps+between+adjacent+nanoapertures%5BTitle%5D)+AND+%22Nano+Lett%22%5BJournal%5D)">Optical field enhancement at cusps between adjacent nanoapertures.</a> Nano Lett. 7 (3), 557-564 (2007).</li>
<li>Al-Ani, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+influence+of+PEG-thiol+derivatives+on+controlling+cellular+and+bacterial+interactions+with+gold+surfaces%5BTitle%5D)+AND+%22Appl+Surf+Sci%22%5BJournal%5D)">The influence of PEG-thiol derivatives on controlling cellular and bacterial interactions with gold surfaces.</a> Appl Surf Sci. 462, 980-990 (2018).</li>
<li>Schuler, B., Hofmann, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-molecule+spectroscopy+of+protein+folding+dynamics-expanding+scope+and+timescales%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Str+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-molecule spectroscopy of protein folding dynamics-expanding scope and timescales.</a> Curr Opin Str Biol. 23 (1), 36-47 (2013).</li>
<li>Kopac, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein+corona%2C+understanding+the+nanoparticle-protein+interactions+and+future+perspectives%3A+A+critical+review%5BTitle%5D)+AND+%22Int+J+Biol+Macromol%22%5BJournal%5D)">Protein corona, understanding the nanoparticle-protein interactions and future perspectives: A critical review.</a> Int J Biol Macromol. 169, 290-301 (2021).</li>
<li>Li, X., Guo, W., Xu, R., Song, Z., Ni, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+interaction+mechanism+between+gold+nanoparticles+and+proteins%3A+Lysozyme%2C+trypsin%2C+pepsin%2C+%CE%B3-globulin%2C+and+hemoglobin%5BTitle%5D)+AND+%22Spectrochim+Acta+A+Mol+Biomol+Spectrosc%22%5BJournal%5D)">The interaction mechanism between gold nanoparticles and proteins: Lysozyme, trypsin, pepsin, γ-globulin, and hemoglobin.</a> Spectrochim Acta A Mol Biomol Spectrosc. 272, 120983(2022).</li>
<li>Emilsson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Strongly+stretched+protein+resistant+poly%28ethylene+glycol%29+brushes+prepared+by+grafting-To%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Appl+Mater+Inter%22%5BJournal%5D)">Strongly stretched protein resistant poly(ethylene glycol) brushes prepared by grafting-To.</a> ACS Appl Mater Inter. 7 (14), 7505-7515 (2015).</li>
<li>Theil, E. C., Liu, X. S., Tosha, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Gated+pores+in+the+ferritin+protein+nanocage%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">Gated pores in the ferritin protein nanocage.</a> Inorg Chim Acta. 361 (4), 868-874 (2008).</li>
<li>Theil, E. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+ferritin+iron+entry+and+exit+problem%5BTitle%5D)+AND+%22Inorg+Chim+Acta%22%5BJournal%5D)">The ferritin iron entry and exit problem.</a> Inorg Chim Acta. 297 (1), 242-251 (2000).</li>
<li>Takahashi, T., Kuyucak, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Functional+properties+of+threefold+and+fourfold+channels+in+Ferritin+D%3Ddeduced+from+electrostatic+calculations%5BTitle%5D)+AND+%22Biophys+J%22%5BJournal%5D)">Functional properties of threefold and fourfold channels in Ferritin D=deduced from electrostatic calculations.</a> Biophys J. 84 (4), 2256-2263 (2003).</li>
<li>Gemeinhardt, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Label-free+imaging+of+single+proteins+secreted+from+living+cells+via+iSCAT+microscopy%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Label-free imaging of single proteins secreted from living cells via iSCAT microscopy.</a> J Vis Exp. (141), e58486(2018).</li>
<li>Piliarik, M., Sandoghdar, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Direct+optical+sensing+of+single+unlabelled+proteins+and+super-resolution+imaging+of+their+binding+sites%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Comm%22%5BJournal%5D)">Direct optical sensing of single unlabelled proteins and super-resolution imaging of their binding sites.</a> Nat Comm. 5 (1), 4495(2014).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Objetivo 100x (NA = 1.25)</td><td>Olympus</td><td>PLN100XO</td><td>Aceite limpio solo con lente Limpiar el pañuelo en un solo movimiento</td></tr><tr><td>Válvula microfluídica bidireccional rotativa 12-1 Válvula solenoide</td> de 3/2 vías <td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Elveflow</td><td></td><td></td></tr><tr><td>4x Objetivo (NA = 0.1)</td><td>Olympus</td><td>PLN4XP</td><td></td></tr><tr><td>Carabina</td><td>RS Componentes</td><td>666-6772</td><td></td></tr><tr><td>Fotodiodo de avalancha (APD)</td><td>Thorlabs</td><td>APD120A/M</td><td>No sobresaturar, ancho de banda de 50 MHz, sensible a la estática</td></tr><tr><td>Diodo láser de mariposa</td><td>Thorlabs</td><td>FPL852S</td><td></td></tr><tr><td>Dispositivo de carga acoplada (cámara)</td><td>Hikrobot</td><td>MV-CE200-10UC</td><td></td></tr><tr><td>Plato de cristalización</td><td>VWR</td><td>216-0065</td><td></td></tr><tr><td>Tarjeta de adquisición de datos&nbsp;</td><td>Instrumentos nacionales</td><td>USB-6361 Frecuencia de</td><td>muestreo de 2 MHz</td></tr><tr><td>Cinta adhesiva de doble cara</td><td>Adhesive Research Inc</td><td>ARcare92712</td><td>Corte la forma adecuada para la celda de flujo con una cortadora láser</td></tr><tr>Campana de<td>etanol</td><td></td><td></td><td>solo para humos, use guantes</td></tr><tr><td>Colimador Fibreport</td><td>Thorlabs</td><td>PAF2-A7B</td><td></td></tr><tr><td>Cubreobjetos de microscopio de vidrio (espesor 0,17 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Placa de media onda</td><td>Thorlabs</td><td>AHWP10M-980</td><td></td></tr><tr><td>Ideal-tek 120 mm, acero inoxidable, pinzas rectas</td><td>RS Components</td><td>282-7472</td><td>Para sujetar muestras y pelar cinta adhesiva de doble cara</td></tr><tr><td>Isopropanol (IPA)</td><td></td><td></td><td>Campana extractora solamente, use guantes</td></tr><tr><td>Pañuelo de limpieza de lentes</td><td>Thorlabs</td><td>MC-5</td><td></td></tr><tr><td>Metrosil piezas de silicona de duplicación rápida A y B</td><td>Metrodent</td><td>MSILR/1&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Portaobjetos de microscopio (75 mm x 26 mm)</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sistema de pinzas ópticas</td><td>modulares Thorlabs</td><td>OTKB/M-CUSTOM</td><td></td></tr><tr><td>Aceite objetivo</td><td>Olympus</td><td></td><td>Use guantes, almacene entre 2oC-8oC</td></tr><tr><td>Montura láser de fotodiodo</td><td>Thorlabs</td><td>CLD1015</td><td></td></tr><tr><td>Controlador piezoeléctrico</td><td>Thorlabs</td><td></td><td></td>MDT693B</tr><tr><td>Etapa piezoeléctrica</td><td>Thorlabs</td><td>Nanomax 300</td><td></td></tr><tr><td>Lente planocóncava (f = -50 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LC1715-B</td><td></td></tr><tr><td>Lente planoconvexa (f = 150 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1433-B</td><td></td></tr><tr><td>Lente planoconvexa (f = 60 mm)</td><td>Thorlabs</td><td>LA1134-B</td><td></td></tr><tr><td>Poli(etilenglicol) metil éter tiol (PEG-tiol) 800 MW</td><td>Sigma Aldrich</td><td>729108</td><td>Almacene entre 2oC-8oC Tubería de</td></tr><tr><td>PTFE (ID: 0.18 mm)</td><td>Vici Jour</td><td>JR-T-6805-M25</td><td></td></tr><tr><td>Tubería de PTFE (ID: 0.8 mm)</td><td>Cole-Parmer</td><td>WZ-21942-72</td><td></td></tr><tr><td>SEM-FIB</td><td>Zeiss</td><td>Crossbeam 550</td><td>Fuente de iones de galio</td></tr><tr><td>Paso corto espejo dicroico 805 nm</td><td>Thorlabs</td><td>DMSP805</td><td></td></tr><tr><td>Espejo de plata</td><td>Thorlabs</td><td>PF-10-03-P01</td><td></td></tr><tr><td>Bomba de jeringa</td><td>Harvard Apparatus</td><td>70-4511</td><td></td></tr><tr><td>Weller Erem 120 mm de acero inoxidable, planas, pinzas redondeadas</td> RS <td>Components</td><td>176-1150</td><td>Para sujetar cubreobjetos de vidrio y pegamento descascarillado de la celda de flujo</td></tr></tbody></table>

monitorización de la dinámica conformacional de proteínas individuales no modificadas mediante nanopinzas plasmónicas

Monitoring Conformational Dynamics of Single Unmodified Proteins using Plasmonic Nanotweezers

Después de la adquisición de datos, el análisis de datos se puede realizar en los datos sin procesar utilizando código de MATLAB para generar seguimientos a partir de los datos sin procesar recopilados por el APD. La Figura 3 muestra un ejemplo de traza de atrapamiento que incluye la línea de base antes del atrapado, el evento de atrapamiento donde se observa un gran cambio en la transmisión (ΔT / T0) y la desviación estándar antes de que el láser se apague durante aproximadamente 5 segundos antes de volver a encenderse. Una reducción significativa en la desviación estándar y el retorno de la transmisión a niveles similares a los basales indica la liberación de proteínas. El desfase lineal se elimina del rastreo mediante la función detrend.m de MATLAB y, a continuación, el valor medio de los datos se vuelve a agregar al rastreo sin tendencia. De vez en cuando, necesitamos eliminar la tendencia de la traza a medida que la configuración se desplaza con el tiempo, lo que provoca una disminución lineal en la transmisión (consulte la traza gris en la Figura 3). Los pequeños cambios en las trazas de referencia antes y después del reventado se deben al ajuste de la etapa para optimizar la línea de base con una desviación estándar mínima, como se muestra en la Figura 4A. A veces, las moléculas de proteína son visibles en el rastro sin ser atrapadas, lo que se denomina proteínas de paso. Las proteínas que pasan aparecen como un cambio brusco en la transmisión, similar a una trampa típica (Figura 4B), pero con una duración significativamente más corta, como se muestra en la Figura 4A. La densidad espectral de potencia (PSD) presenta otro análisis para confirmar el atrapamiento de proteínas al proporcionar intensidad de señal a varias frecuencias. Los movimientos conformacionales de las proteínas se observan típicamente en el rango de &gt;1 μs mediante métodos de espectroscopia de molécula única40. La Figura 4C demuestra que, en comparación con la línea de base, el atrapamiento de una proteína conduce a una mayor intensidad de señal, al menos dentro del rango de 10 kHz (&gt; 100 μs). También destaca la importancia de alinear la etapa con una línea de base optimizada, ya que una línea de base incorrecta podría aumentar el ruido a frecuencias entre 50 y 500 Hz, un rango de frecuencia superpuesto con movimientos conformacionales de proteínas.
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig03.jpg"> 
Figura 3: Traza de captura completa para una sola proteína. Traza representativa de una trampa completa, incluida la línea de base, la captura de una proteína y la liberación de la proteína. Los saltos en la traza antes y después del atrapado se deben a la alineación. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig03large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig04.jpg"> 
Figura 4: Eventos de rastreo comunes. (A) Ejemplos de una alineación de una línea de base mala a una buena y una proteína que pasa cerca del punto caliente. (B) Traza de atrapamiento que muestra el proceso desde la línea de base cuando el punto caliente de DNH está vacío hasta cuando la proteína está atrapada. (C) Gráfico de densidad espectral de potencia (PSD) entre las líneas de base buenas y malas representadas en (A) y la proteína atrapada en (B). Los valores más altos de PSD indican un mayor ruido a frecuencias particulares. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig04large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
La mayoría de los eventos de reventado siguen el mismo patrón general que el seguimiento de la figura 3, aunque pueden surgir problemas ocasionales durante los experimentos. Para la mayoría de los experimentos, la proteína debe liberarse manualmente apagando el láser una vez que se complete el experimento deseado. En algunos casos, sin embargo, la proteína puede salir de la trampa sin intervención, como se muestra en la Figura 5A. Por el contrario, a veces las proteínas pueden permanecer en el sitio de captura incluso después de apagar el láser, probablemente debido a que la proteína se adhiere a la muestra. Este pegado da como resultado un rastro ruidoso después de apagar y encender el láser (consulte la Figura 5B). La probabilidad de que esto ocurra depende de la proteína, ya que algunas proteínas son más propensas a la adsorción superficial41,42. El uso de un recubrimiento como el PEG-tiol puede reducir las posibilidades de que las proteínas se peguen39,43. A menos que se desee, como el estudio de las interacciones proteína-proteína, otro problema es el doble atrapamiento, donde una segunda proteína queda atrapada después de la primera. Esto se caracteriza por otro aumento brusco en la transmisión, similar a la primera trampa, y un cambio en la desviación estándar (ver Figura 5C). 
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig05.jpg"> 
Figura 5: Ejemplos de eventos de atrapamiento no deseados. (A) Liberación no intencional de una proteína desde el punto caliente de DNH. (B) Ejemplo de proteína que se atasca en la superficie de la muestra en el punto caliente de DNH. (C) El salto de traza ocurre cuando una segunda proteína queda atrapada mientras la primera aún permanece en el punto caliente de DNH. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig05large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Un experimento representativo llevado a cabo sobre la carga de hierro in situ en una molécula de apo-ferritina demuestra el uso de nanotweezers plasmónicas como herramienta para investigar la dinámica conformacional de las proteínas29. La ferritina es una proteína transportadora de hierro que existe en dos estados: la apo-ferritina, que no contiene hierro, y la holoferritina, que está llena de hierro44,45. El hierro ferroso ingresa a la proteína a través de canales 3 veces donde se oxida a hierro férrico y se almacena en el núcleo de la proteína46. La Figura 6A muestra una traza típica de atrapamiento de apo-ferritina con una solución ferrosa infundida durante más de 20 minutos mientras la proteína está atrapada. Las trazas de 20 s tomadas a lo largo de toda la traza en los puntos b-e proporcionan información sobre los cambios que se producen en la proteína a lo largo del tiempo. En la Figura 6B, la apo-ferritina está atrapada en un tampón PBS estándar y no se observan cambios significativos en la traza. La figura 6C, D muestra fluctuaciones en el S.D de las trazas, que son causadas por la carga de hierro en la proteína a través de sus 3 canales, lo que resulta en un estado más dinámico (apo-) donde los canales están abiertos, y un estado más compacto (holo-) con los canales cerrados. Al llenarse la molécula de ferritina con hierro, pasó a su holoforma, lo que resultó en un rastro de atrapamiento estable, como se muestra en la Figura 6E. Las funciones de densidad de probabilidad (PDF) en las Figuras 6B-E muestran aún más los cambios que experimenta la proteína al exponerse a diferentes condiciones de solución a lo largo del tiempo.
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/68093/68093fig06.jpg"> 
Figura 6: Carga de hierro in situ en una apoferritina atrapada. (A) Traza de transmisión completa de un DNH con una molécula de apoferritina atrapada, seguida de la inyección de una solución ferrosa en el sitio de captura para observar los cambios conformacionales de la ferritina asociados con la carga de hierro. (B) Traza de atrapamiento de 20 segundos de una apoferritina atrapada antes de que la solución ferrosa alcanzara el punto caliente. (C, D) Trazas de atrapamiento de 20 s después de que la molécula de apoferritina se expuso a la solución ferrosa. Los segmentos azul y púrpura marcan la S.D superior e inferior de la traza, lo que indica conformaciones flexibles y rígidas de ferritina, respectivamente. (E) Trazas de atrapamiento de 20 s después de que la apoferritina se expuso a la solución ferrosa durante &gt;20 minutos. Los gráficos de la función de densidad de probabilidad (PDF) a la derecha muestran la distribución de la transmisión y están codificados por colores para los segmentos azul y morado. Esta cifra ha sido modificada de29. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/68093fig06large.jpg" target="_blank">Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>
Figura complementaria 1: Muestra de oro DNH montada en la celda de flujo impresa en 3D. La muestra se coloca en una ranura especial y se adhiere a la celda de flujo con cinta adhesiva de PET de doble cara. Los parámetros clave y las mediciones asociadas para el diseño de nuestra celda de flujo están etiquetados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-1%20Sample%20mounted%20in%20flow%20cell_amended.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 2: Parte posterior de la celda de flujo con muestra de DNH dorado montada y pared interior etiquetada. La muestra se sella en la celda de flujo utilizando silicona duplicada. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-2%20Inner%20wall%20of%20hole%20in%20flow%20cell.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>
Figura complementaria 3: Diagrama de la celda de flujo con DNH dorado montado con orificios de entrada y salida etiquetados. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/68093/SI-3%20Intake%20and%20outtake%20holes.tif" target="_blank">Haga clic aquí para descargar este archivo.</a>

Monitorización de la dinámica conformacional de proteínas individuales no modificadas mediante nanopinzas plasmónicas

Current single-molecule techniques to characterize proteins typically require labels, tethers, or the use of non-native solution conditions. Such changes ...

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Research

Investigación

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